Καλλιέργεια βακτηρίων: μέθοδοι, αρχές, βήματα και προϋποθέσεις

2024 Συγγραφέας: Angel Austin | [email protected]. Τελευταία τροποποίηση: 2023-12-17 05:22

Οι μικροοργανισμοί στη φύση γύρω μας βρίσκονται παντού: στα εδάφη, στα υδάτινα σώματα, στις επιφάνειες διαφόρων αντικειμένων, κατοικούνται από αυτούς ανθρώπους και ζώα. Όλα αυτά μπορούν να χρησιμεύσουν ως πηγές μικροβιακής μόλυνσης των τροφίμων, των φαρμάκων και των γραμμών παραγωγής. Η καλλιέργεια βακτηρίων είναι απαραίτητη για τη μελέτη των ιδιοτήτων, των αναγκών και των χαρακτηριστικών τους. Αυτό, με τη σειρά του, είναι ένα σημαντικό βήμα για την ανάπτυξη διαφόρων φαρμάκων, την εργαστηριακή διάγνωση ασθενειών, τον υπολογισμό των αντιδραστήρων παραγωγής και πολλά άλλα.

Γενικές έννοιες

Η καλλιέργεια βακτηρίων στη μικροβιολογία αναφέρεται στην καλλιέργεια μικροοργανισμών που πραγματοποιείται στο εργαστήριο. Με τη σειρά τους, τα μικρόβια που έχουν αναπτυχθεί σε ένα επιλεγμένο θρεπτικό μέσο ονομάζονται καλλιέργεια. Οι καλλιέργειες μπορούν να αναμειχθούν εάν σχηματίζονται από διαφορετικούς τύπους μικροοργανισμών και καθαρές εάν αντιπροσωπεύονται από έναν μόνο τύπο βακτηρίων.

Εάν είναι θρεπτικόΜόνο ένα κύτταρο τοποθετείται στο μέσο και μια ομάδα ατόμων λαμβάνεται ως αποτέλεσμα της αναπαραγωγής του, τότε αυτό το σύνολο μικροοργανισμών ονομάζεται κλώνος. Όταν ένας κλώνος αναπτύσσεται στο σημείο που γίνεται ορατός με γυμνό μάτι, αυτή η συλλογή βακτηρίων ονομάζεται αποικία.

Συνήθως η καλλιέργεια βακτηρίων που απομονώνονται από διαφορετικές πηγές πραγματοποιείται χωριστά το ένα από το άλλο. Κάθε τέτοια ξεχωριστά αναπτυγμένη ομάδα μικροβίων ονομάζεται στέλεχος. Έτσι, εάν ένας τύπος σταφυλόκοκκου απομονωθεί από τρεις πηγές (ή διαφορετικές μερίδες του ίδιου προϊόντος, διαφορετικούς ανθρώπους), μιλούν για τρία στελέχη αυτού του τύπου σταφυλόκοκκου.

Αυξητικοί παράγοντες βακτηρίων

Αυτά περιλαμβάνουν διάφορα αμινοξέα, λιπίδια, βάσεις πουρινών και άλλες ενώσεις απαραίτητες για την ανάπτυξη μικροοργανισμών. Ορισμένα μικρόβια μπορούν να παράγουν ανεξάρτητα τις ουσίες που χρειάζονται, ενώ άλλα πρέπει να τις λάβουν σε τελική μορφή. Σύμφωνα με τις ανάγκες των μικροοργανισμών σε ορισμένους αυξητικούς παράγοντες, πραγματοποιείται αναγνώριση και διαφοροποίηση των βακτηρίων. Επίσης, αυτή η παράμετρος είναι σημαντική για τη σωστή προετοιμασία ενός θρεπτικού μέσου για εργαστηριακές και βιοτεχνολογικές εργασίες:

Αμινοξέα. Τα βακτήρια μπορεί να απαιτούν ένα συγκεκριμένο αμινοξύ ή ομάδα οξέων. Έτσι, τα κλωστρίδια χρειάζονται λευκίνη και τυροσίνη, οι στρεπτόκοκκοι χρειάζονται λευκίνη και αργινίνη. Οι μικροοργανισμοί που απαιτούν αμινοξέα από το εξωτερικό για να αναπτυχθούν ονομάζονται αυξότροφοι.
Βάσεις πουρίνης και πυριμιδίνης, καθώς και τα παράγωγά τους (αδενίνη, γουανίνη και άλλα). Αποτελούν σημαντικό παράγοντα για την ανάπτυξη πολλώνΕίδη στρεπτόκοκκου.
Βιταμίνες. Αποτελούν μέρος των συνενζύμων που απαιτούνται από τα βακτήρια. Έτσι, το νικοτινικό οξύ, καθώς και το αμίδιο του, που αποτελούν μέρος των NAD και NADP, χρειάζονται από τα βακτήρια της διφθερίτιδας και της σιγκέλας. Η θειαμίνη, ως αναπόσπαστο μέρος του πυροφωσφορικού, απαιτείται από τον Staphylococcus aureus, τον πνευμονιόκοκκο, τη βρουκέλλα. Το παντοθενικό οξύ, το οποίο αποτελεί μέρος του συνενζύμου CoA, απαιτείται από τους βάκιλλους του τετάνου και ορισμένους τύπους στρεπτόκοκκου. Τα κυτοχρώματα, και επομένως το φολικό οξύ, οι αίμες και η βιοτίνη που τα σχηματίζουν, είναι απαραίτητα για το Mycobacterium tuberculosis και το Haemophilus influenzae.

Περιβαλλοντικές Απαιτήσεις

Συνθήκες για τα μέσα καλλιέργειας για την καλλιέργεια βακτηρίων:

Διατροφή. Πρέπει να περιέχουν ουσίες, επιπλέον, σε εύπεπτη μορφή, απαραίτητες για τη διατροφή και την αναπλήρωση ενέργειας από τους μικροοργανισμούς. Αυτά περιλαμβάνουν οργανογόνα και μέταλλα. Ορισμένοι μικροοργανισμοί απαιτούν επιπλέον βιταμίνες και αμινοξέα που δεν μπορούν να συνθέσουν.
Βέλτιστο επίπεδο pH. Επηρεάζει τη διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης και, κατά συνέπεια, την ικανότητα απορρόφησης θρεπτικών συστατικών από το βακτήριο. Τις περισσότερες φορές, η τιμή του pH πρέπει να είναι στο επίπεδο 7, 2-7, 4. Πολλοί μικροοργανισμοί κατά τη διάρκεια της ζωής τους παράγουν προϊόντα με όξινες ή αλκαλικές αντιδράσεις και για να μην μεταβάλλεται το pH του θρεπτικού μέσου, πρέπει να είναι buffer.
Ισοτονικό. Η ωσμωτική πίεση στο θρεπτικό μέσο για την καλλιέργεια βακτηρίων θα πρέπει να έχει τις ίδιες τιμές μεμέσα στα μικροβιακά κύτταρα. Συνήθως αντιστοιχεί σε διάλυμα NaCl 0,5%.
Στειρότητα. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η εμφάνιση ξένων βακτηρίων θα παραμορφώσει τα αποτελέσματα της μελέτης του αναλυθέντος στελέχους.
Επίπεδο υγρασίας. Αυτός ο δείκτης, μαζί με τη συνοχή του μέσου, θα πρέπει να έχει τα βέλτιστα χαρακτηριστικά για έναν συγκεκριμένο τύπο βακτηρίων.
Δυνατότητα οξειδοαναγωγής (RH2). Δείχνει την αναλογία των ουσιών που δίνουν και δέχονται ηλεκτρόνια, καθώς και το επίπεδο κορεσμού οξυγόνου του θρεπτικού μέσου. Για αερόβια και αναερόβια, οι συνθήκες για την καλλιέργεια βακτηρίων διαφέρουν κάπως σε αυτόν τον δείκτη. Οι αναερόβιοι μικροοργανισμοί αναπαράγονται καλύτερα σε τιμές RH2 κάτω από 5 και οι αερόβιοι μικροοργανισμοί τουλάχιστον 10.
Ομοιομορφία. Είναι σημαντικό το μέσο καλλιέργειας να περιέχει σταθερές ποσότητες των επιμέρους συστατικών του. Επιπλέον, προτιμώνται διαυγή διαλύματα, τα οποία διευκολύνουν την παρακολούθηση της ανάπτυξης των καλλιεργειών ή την παρατήρηση της μόλυνσης.

Τύποι μέσων καλλιέργειας

Η επιλογή ενός συγκεκριμένου μέσου για την ανάπτυξη μικροοργανισμών επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων είναι τα χαρακτηριστικά της διατροφής τους και ο σκοπός της μελέτης. Τα κύρια χαρακτηριστικά στα οποία βασίζεται η ταξινόμηση των θρεπτικών μέσων είναι:

1. Συστατικά. Σύμφωνα με τις αρχικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία του υποστρώματος, διακρίνονται:

φυσικά, τα οποία παρασκευάζονται από προϊόντα ζωικής ή φυτικής προέλευσης (π.χ. κρέας, γάλα, φρούτα) και είναι κατάλληλα για καλλιέργεια μικτώνκαλλιέργειες;
ημισυνθετικό, στο οποίο τα ακριβά φυσικά προϊόντα διατροφής αντικαθίστανται από μη διατροφικά προϊόντα (για παράδειγμα, οστεάλευρα, θρόμβοι αίματος) και τα οποία είναι βέλτιστα για την καλλιέργεια ορισμένων τύπων βακτηρίων ή την απομόνωση των μεταβολικών τους προϊόντων από περιβάλλον;

Το

συνθετικό, το οποίο παρασκευάζεται από ακριβείς ποσότητες χημικών ενώσεων, έχει γνωστή σταθερή σύνθεση και είναι εύκολα αναπαραγώγιμα.

2. Συνέπεια (πυκνότητα). Διάκριση περιβαλλόντων:

υγρό;
πυκνά;
ημι-υγρό.

Τα δύο τελευταία παρασκευάζονται από ειδικά διαλύματα ή υγρές ουσίες με την προσθήκη άγαρ-άγαρ ή ζελατίνης για τη δημιουργία της απαιτούμενης πυκνότητας. Επιπλέον, ένα πυκνό περιβάλλον για την ανάπτυξη βακτηρίων είναι ο ορός θρόμβου αίματος, οι πατάτες, τα μέσα πυριτικής πηκτής, η καραγενάνη.

3. Χημική ένωση. Σε αυτή τη βάση, τα περιβάλλοντα είναι:

απλό, η λίστα των οποίων είναι σύντομη είναι Ζωμός πεπτόνης κρέατος (MBB), Ζωμός και άγαρ Hottinger, Άγαρ πεπτόνης κρέατος (MPA), θρεπτική ζελατίνη και νερό πεπτόνης.
σύμπλεγμα, παρασκευασμένο από απλά με προσθήκη αίματος, ορού γάλακτος, υδατανθράκων και άλλων ουσιών.

4. Ραντεβού. Διακρίνονται τα ακόλουθα θρεπτικά μέσα:

Τα

main χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη πολλών παθογόνων μικροβίων (συνήθως απλή σύνθεση);

Τα

χρησιμοποιούνται ειδικά για την απομόνωση και την καλλιέργεια βακτηρίων που δεν αναπτύσσονται σε απλά υποστρώματα.

Τα

επιλεκτικά (είναι επίσης επιλεκτικά) είναι κατάλληλα για την απομόνωση συγκεκριμένου τύπου βακτηρίων και αναστέλλουν την ανάπτυξη σχετικών μικροβίων (επιλεκτικότηταδημιουργείται με την προσθήκη ορισμένων ουσιών στα μέσα, όπως αντιβιοτικά ή άλατα, ή με προσαρμογή του pH),

Τα

διαφορικά διαγνωστικά καθιστούν δυνατή τη διάκριση ενός τύπου βακτηρίων από τον άλλο αξιολογώντας την ενζυματική δραστηριότητα, για παράδειγμα, του μέσου;

Απαιτούνται

συντηρητικά για τον αρχικό εμβολιασμό με την επακόλουθη μεταφορά δειγμάτων, καθώς εμποδίζουν το θάνατο μικροοργανισμών, καθώς και αναστέλλουν την ανάπτυξη άλλων βακτηρίων.

Προετοιμασία πολυμέσων

Το πιο σημαντικό βήμα στην καλλιέργεια αναερόβιων βακτηρίων είναι η παρασκευή ενός κατάλληλου θρεπτικού μέσου. Αφού επιλεγούν οι βέλτιστες παράμετροι, προχωρήστε στα ακόλουθα στάδια:

ζύγιση, επιλέγοντας δείγμα εξαρτημάτων σε αναλυτικό ζυγό,
η διάλυση πραγματοποιείται σε απεσταγμένο νερό που έχει θερμανθεί στους 70°C και τα φωσφορικά άλατα, τα μικρο- και τα μακροάλατα διαλύονται χωριστά.
βράζει σε υδατόλουτρο για δύο λεπτά,
προσδιορισμός pH με χαρτί ένδειξης ή ποτενσιόμετρο;
διήθηση μέσω υγρού υφάσματος ή χάρτινων φίλτρων για υγρά καθώς και λιωμένα πυκνά μέσα, και μέσω φίλτρου βαμβακερής γάζας για μέσα άγαρ·
εμφιάλωση σε χωρητικότητα 3/4;
μέτρια εξαρτώμενη αποστείρωση;
ο έλεγχος για τη στειρότητα πραγματοποιείται με καθίζηση για δύο ημέρες σε θερμοστάτη, ακολουθούμενη από προβολή;
χημικός έλεγχος για τον καθορισμό του pH και την περιεκτικότητα των απαραίτητωναντικείμενα;
βιολογικός έλεγχος με δοκιμαστικό εμβολιασμό.

Αποστείρωση γυάλινων σκευών και μέσων

Μία από τις βασικές αρχές της βακτηριακής καλλιέργειας είναι η στειρότητα. Η ανάπτυξη και ανάπτυξη ξένων μικροοργανισμών μπορεί να επηρεάσει τα χαρακτηριστικά του θρεπτικού μέσου αλλάζοντας τη χημική του σύνθεση και το pH του. Η αποστείρωση είναι η κύρια προϋπόθεση για την καλλιέργεια καθαρών καλλιεργειών. Στην πράξη, αυτός ο όρος σημαίνει τις μεθόδους καταστροφής όλων των μορφών ζωής στην επιφάνεια και στον όγκο των αποστειρωμένων αντικειμένων. Τα αγγεία, τα εργαλεία που χρησιμοποιούνται, τα μέσα και άλλα αντικείμενα που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της μελέτης αποστειρώνονται.

Μερικοί τύποι αποστείρωσης:

Ανάφλεξη. Η αποστείρωση βρόχων και βελόνων για σπορά, γυάλινες διαφάνειες, ορισμένα όργανα μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας καυστήρα ή λυχνία αλάτων.
Βράσιμο. Κατάλληλο για χειρισμό συριγγών, βελόνων, τροφίμων, αλλά δεν σκοτώνει τα βακτηριακά σπόρια.
Αποστείρωση με ξηρή θερμότητα. Γίνεται σε ειδικό θάλαμο ξήρανσης και είναι κατάλληλο για την επεξεργασία φιαλών, δοκιμαστικών σωλήνων και άλλων εργαστηριακών υαλικών.
Αποστείρωση με ατμό. Εκτελούμενη σε αυτόκλειστο, αυτή η μέθοδος είναι εξαιρετικά αποτελεσματική. Αλλά δεν είναι κατάλληλο για θρεπτικά μέσα που περιέχουν πρωτεΐνες ή άλλες ενώσεις που διασπώνται σε υψηλές θερμοκρασίες. Πιο φειδωλός μπορεί να ονομαστεί τυνταλισμός. Πραγματοποιείται στο Boiler Koch και συνδυάζει τη βλάστηση των σπορίων με την καταστροφή τους.
Παστερίωση. Χρησιμοποιείται για μέσα που αλλάζουν τις ιδιότητές τους όταν βράζονται (για παράδειγμα, γάλα, κρασί, μπύρα), ικανάαπαλλάξτε τους από μικροοργανισμούς που δεν φέρουν σπόρια. Η θερμοκρασία επεξεργασίας είναι μόνο 50-60 ° C για δεκαπέντε έως τριάντα λεπτά. Σε ορισμένες περιπτώσεις, χρησιμοποιείται ψυχρή αποστείρωση, η οποία πραγματοποιείται με φίλτρα ή ακτίνες UV.

Συνθήκες καλλιέργειας βακτηρίων

Η ανάπτυξη και ανάπτυξη βακτηρίων είναι δυνατή μόνο υπό ορισμένους παράγοντες και τις τιμές καθενός από αυτούς:

1. Θερμοκρασία. Υπάρχουν τρεις ομάδες βακτηρίων που διαφέρουν στις προτιμήσεις θερμοκρασίας:

Τα

θερμόφιλα, ή θερμόφιλα μικρόβια, αναπτύσσονται στους 45-90°C, πράγμα που σημαίνει ότι δεν πολλαπλασιάζονται σε ανθρώπινους και ζωικούς οργανισμούς.

ψυχρόφιλα, ή μικροοργανισμοί που αγαπούν το κρύο, προτιμούν θερμοκρασίες στην περιοχή από 5-15 °C και καλλιεργούνται σε ψυκτικές αποθήκες·

μεσόφιλα, αναπτύσσονται σε θερμοκρασία 25-37 ° C, περιλαμβάνουν το μεγαλύτερο μέρος των βακτηρίων.

2. Φως. Είναι χαρακτηριστικό της καλλιέργειας φωτοτροφικών βακτηρίων, αφού πραγματοποιούν τη φωτοσυνθετική διαδικασία. Αλλά για τα περισσότερα μικρόβια, ο φωτισμός δεν είναι απαραίτητη προϋπόθεση. Και ακόμη και αντίστροφα, η ηλιακή υπεριώδης ακτινοβολία μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξή τους.

3. Νερό. Όλοι οι μικροοργανισμοί χρειάζονται νερό σε προσβάσιμη (υγρή) μορφή. Γι' αυτό τα κατεψυγμένα τρόφιμα έχουν ελάχιστη έως καθόλου ανάπτυξη βακτηρίων.

4. Οξύτητα του περιβάλλοντος. Αυτή η αρχή της καλλιέργειας βακτηρίων έχει ήδη συζητηθεί λεπτομερώς παραπάνω.

5. Εξαερισμός. Το οξυγόνο, ως χημικό στοιχείο, είναι αναπόσπαστο μέρος του νερού και ένας σημαντικός αριθμός ενώσεων που χρησιμοποιούνται γιακαλλιέργεια μικροοργανισμών. Το αέριο οξυγόνο μπορεί επίσης να περιέχεται σε νερό και άλλα υγρά σε διαλυμένη μορφή. Ένα σημαντικό μέρος των βακτηρίων χρειάζεται συνεχή παροχή μορίων οξυγόνου. Αλλά για έναν αριθμό μικροοργανισμών, είναι περιττό ή, χειρότερα, το αέριο οξυγόνο είναι τοξικό για αυτούς, καθώς δεν έχουν καταλάση και υπεροξειδάση, που καταστρέφουν τα τοξικά αναπνευστικά προϊόντα. Επομένως, το πιο σημαντικό βήμα στην καλλιέργεια αναερόβιων βακτηρίων είναι η απομάκρυνση των μορίων O₂ από το θρεπτικό υλικό.

6. Καλλιέργεια μικροοργανισμών. Η καλλιέργεια αερόβιων και αναερόβιων βακτηρίων πραγματοποιείται σε διαφορετικά στρώματα του περιβάλλοντος και με διαφορετικούς τρόπους.

Καλλιέργεια αερόβιων μικροοργανισμών

Η καλλιέργεια αερόβιων βακτηρίων απαιτεί μοριακό οξυγόνο. Για να ληφθούν καθαρές καλλιέργειες αεροβίων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν με επιτυχία στην ιατρική και τη βιομηχανία τροφίμων, χρησιμοποιούνται οι ακόλουθες μέθοδοι:

επιφάνεια που αναπτύσσεται σε πυκνά μέσα ή σε υγρά μέσα (το λεπτό στρώμα τους) όταν το οξυγόνο προέρχεται απευθείας από τον αέρα;
βαθιά καλλιέργεια σε υγρά μέσα, όταν η αύξηση της ποσότητας του οξυγόνου που διαλύεται σε αυτά επιτυγχάνεται με σταθερό αερισμό.

Καλλιέργεια αναερόβιων μικροοργανισμών

Η βασική αρχή της καλλιέργειας βακτηρίων αυτού του τύπου είναι η ελάχιστη επαφή τους με το ατμοσφαιρικό οξυγόνο. Η παροχή συνθηκών για την ανάπτυξή τους είναι πολύ πιο δύσκολη από ό,τι για τα αερόβια. Οι ακόλουθες μέθοδοι χρησιμοποιούνται για την απομόνωση αναερόβιων από μοριακό O₂:

Σωματική. Αυτή η μέθοδος καλλιέργειας αναερόβιων βακτηρίων περιορίζεται στην καλλιέργειά τους σε μια ειδική συσκευή κενού - έναν μικροαναερόστατο. Ο αέρας σε αυτό αντικαθίσταται από ένα ειδικό μείγμα αερίων αζώτου με την προσθήκη 10% υδρογόνου και 5% διοξειδίου του άνθρακα.
Χημικό. Αυτά περιλαμβάνουν: χρήση απορροφητικών παραγόντων (π.χ. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) ή αναγωγικούς παράγοντες (όπως ασκορβικό οξύ).
Βιολογικό. Ανάγεται στη συγκαλλιέργεια αερόβιων και αναερόβιων σε ένα κλειστό σύστημα. Αυτή η μέθοδος καλλιέργειας βακτηρίων περιλαμβάνει τη σπορά του μισού ενός τρυβλίου Petri με μερικά από τα αερόβια είδη βακτηρίων και του άλλου μισού με το αναερόβιο που μελετήθηκε. Η ανάπτυξή του θα ξεκινήσει τη στιγμή που θα εξαντληθεί όλο το οξυγόνο.

Οι ακόλουθες μέθοδοι σποράς είναι κατάλληλες για την καλλιέργεια αναερόβιων βακτηρίων:

στο επιφανειακό στρώμα;
στο επιφανειακό στρώμα γεμάτο με αποστειρωμένη παραφίνη;
στο πάχος ενός πυκνού θρεπτικού μέσου;
σε βαθιά στρώματα παχύρρευστων μέσων.

Λήψη καθαρής καλλιέργειας

Οι μικροβιολόγοι συνήθως εργάζονται με δείγματα που κατοικούνται από πολλούς διαφορετικούς τύπους μικροβίων. Ωστόσο, για τον προσδιορισμό της συστηματικής θέσης των μικροοργανισμών (οικογένεια, γένος, είδος), καθώς και για τη μελέτη των χαρακτηριστικών τους, είναι απαραίτητο να απομονωθούν και να αναπτυχθεί μια καθαρή καλλιέργεια. Έχουν μεγάλη σημασία σε πολλές βιομηχανίες τροφίμων, για παράδειγμα, τυρί, ψωμί, κβας, κρασί κ.λπ. Η καλλιέργεια βακτηρίων γαλακτικού οξέος καθιστά δυνατή την απόκτησηβασικό συστατικό για την παραγωγή γαλακτοκομικών προϊόντων που έχουν υποστεί ζύμωση, ζύμης, κακάο, ενσίρωσης ακόμα και πλαστικού.

Η μέθοδος απομόνωσης μιας καθαρής καλλιέργειας σε πυκνό μέσο βασίζεται στον μηχανικό διαχωρισμό των κυττάρων μικροοργανισμών με την επακόλουθη απομονωμένη καλλιέργειά τους. Το δείγμα μεταφέρεται σε στείρο όγκο νερού ή φυσιολογικού ορού (όγκος 10-100 ml) και στη συνέχεια ανακινείται για δύο λεπτά. Προκειμένου να εξαχθούν μικροοργανισμοί που βρίσκονται στο πάχος του υπό μελέτη υλικού (για παράδειγμα, λουκάνικα ή τυρί), πραγματοποιείται πρώτα τρίψιμο των τεμαχίων δείγματος με αποστειρωμένα εργαλεία με άμμο. Το υλικό που έχει υποστεί προκαταρκτική προετοιμασία, βάρους 1 g ή όγκου 1 ml, αραιώνεται με αποστειρωμένο νερό κατά 10, 100, 1000 κ.λπ. φορές. Επιλέγεται ο βαθμός αραίωσης που δίνει συγκέντρωση κυττάρων που αντιστοιχεί στις δυνατότητες της μεθόδου.

Η επακόλουθη καλλιέργεια μικροοργανισμών είναι η παρασκευή ενός θρεπτικού μέσου. Συνήθως επιλέγεται ένα πυκνό μέσο (MPA). Πρώτα τήκεται και ψύχεται στους 45-50 °C και μόνο μετά χύνεται σε πολλά τρυβλία Petri (τρία έως πέντε τεμάχια), στον πάτο των οποίων τοποθετούνται μάκτρα από τη δοκιμαστική ουσία διαφόρων συγκεντρώσεων. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται ανάμιξη του ακόμη μη κατεψυγμένου θρεπτικού μέσου και του υλικού που εισάγεται σε αυτό. Έτσι στερεώνονται τα κύτταρα σε διάφορα σημεία του όγκου του υποστρώματος.

Στη συνέχεια, τα πιάτα Petri τοποθετούνται σε θερμοστάτη για 2 ημέρες στους 22 °C. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται σε τέτοιο βαθμό που η αποικία που σχηματίζεται από κάθε ένα από τα κύτταρα γίνεται ορατή με γυμνό μάτι. Κάθε ένα από αυτά είναι μια καθαρή καλλιέργεια του τύπου βακτηρίων από τα κύτταρα των οποίων προέρχεταιτριαντάφυλλο.

Στη συνέχεια, από τα πιάτα Petri, οι μικροοργανισμοί υποκαλλιεργούνται σε χωριστούς δοκιμαστικούς σωλήνες γεμάτους με θρεπτικό μέσο. Με αυτόν τον τρόπο, οι καθαρές καλλιέργειες απομονώνονται από ένα μικτό δείγμα. Αυτή η μέθοδος φέρει το όνομα του προγραμματιστή της - R. Koch. Ονομάζεται επίσης κοινώς μέθοδος κυπέλλου, ή εξαντλητική σπορά. Αφού ληφθούν καθαρές καλλιέργειες διαφόρων τύπων βακτηρίων, προσδιορίζονται το σχήμα, τα σπόρια και οι οικογένειες τους.

Όλες οι εργασίες πρέπει να εκτελούνται σύμφωνα με τις αρχές της ασηψίας. Για να αποφευχθεί η πρόωρη ανάπτυξη μικροοργανισμών, η μελέτη θα πρέπει να διεξάγεται αμέσως μετά τη δειγματοληψία. Το νερό της βρύσης αναλύεται μετά την αποστράγγιση των πρώτων μερίδων, καθώς μπορεί να περιέχουν μικρόβια συσσωρευμένα σε σωλήνες και βρύσες. Η μικροχλωρίδα των φρούτων, των μούρων και των λαχανικών εντοπίζεται κυρίως στην επιφάνεια (φλούδα), επομένως, πραγματοποιούνται πλύσεις από αυτήν. Για να το κάνετε αυτό, τοποθετήστε το έμβρυο σε ένα αποστειρωμένο δοχείο και γεμίστε το με την απαιτούμενη ποσότητα νερού. Στη συνέχεια ανακινούνται αρκετά δυνατά και το νερό χύνεται σε άλλο δοχείο. Οι καλλιέργειες από υφασμάτινα προϊόντα λαμβάνονται επίσης σε μπατονέτες, αλλά προηγουμένως κόβονται κομμάτια συγκεκριμένου μεγέθους.