Η κυτταρική καλλιέργεια εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις συνθήκες. Διαφέρουν για κάθε τύπο κυττάρου, αλλά συνήθως αποτελούνται από ένα κατάλληλο δοχείο με υπόστρωμα ή μέσο που παρέχει τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά (αμινοξέα, υδατάνθρακες, βιταμίνες, μέταλλα), αυξητικούς παράγοντες, ορμόνες και αέρια (CO2, O2) και ρυθμίζει τη σωματική -χημικό περιβάλλον (ρυθμιστικό pH, ωσμωτική πίεση, θερμοκρασία). Τα περισσότερα κύτταρα απαιτούν ένα επιφανειακό ή τεχνητό υπόστρωμα (συγκολλητική ή μονοστιβαδική καλλιέργεια), ενώ άλλα μπορούν να πολλαπλασιαστούν ελεύθερα σε ένα μέσο καλλιέργειας (καλλιέργεια εναιωρήματος). Η διάρκεια ζωής των περισσότερων κυττάρων καθορίζεται γενετικά, αλλά ορισμένες κυτταροκαλλιέργειες έχουν μετατραπεί σε αθάνατα κύτταρα που θα αναπαράγονται επ' αόριστον εάν δημιουργηθούν οι βέλτιστες συνθήκες.
Ορισμός
Sο ορισμός εδώ είναι αρκετά απλός. Στην πράξη, ο όρος «κυτταρική καλλιέργεια» αναφέρεται πλέον στην καλλιέργεια κυττάρων που προέρχονται από πολυκύτταρους ευκαρυώτες, ιδιαίτερα ζωικά κύτταρα, σε αντίθεση με άλλους τύπους καλλιέργειας. Οι μέθοδοι ιστορικής ανάπτυξης και καλλιέργειας σχετίζονται στενά με την καλλιέργεια ιστών και οργάνων. Η καλλιέργεια ιών σχετίζεται επίσης με κύτταρα ως ξενιστές για ιούς.
Ιστορία
Οι εργαστηριακές τεχνικές για τη λήψη και την καλλιέργεια κυττάρων που διαχωρίστηκαν από την αρχική πηγή ιστού έγιναν πιο ισχυρές στα μέσα του 20ού αιώνα. Οι κύριες ανακαλύψεις σε αυτόν τον τομέα έγιναν από επιστήμονες από το Πανεπιστήμιο Yale.
Ανακάλυψη στα μέσα του αιώνα
Αρχικά, η λήψη και η καλλιέργεια κυττάρων γινόταν για να βρεθεί πανάκεια για πολλούς επικίνδυνους ιούς. Αρκετοί ερευνητές ανακάλυψαν ότι πολλά στελέχη ιών μπορούν με ασφάλεια να ζήσουν, να ευδοκιμήσουν και να πολλαπλασιαστούν σε τεχνητά αναπτυγμένα ζωικά κύτταρα ή ακόμα και ολόκληρα όργανα που φυλάσσονται αυτόνομα σε ειδικές φιάλες. Κατά κανόνα, κύτταρα οργάνων ζώων που είναι όσο το δυνατόν πιο κοντά στον άνθρωπο χρησιμοποιούνται για τέτοιες δοκιμές - για παράδειγμα, ανώτερα πρωτεύοντα όπως οι χιμπατζήδες. Όλες αυτές οι ανακαλύψεις έγιναν τη δεκαετία του 1940, όταν τα πειράματα σε ανθρώπους ήταν πιο σχετικά για ορισμένους λόγους.
Μεθοδολογία
Τα κύτταρα μπορούν να απομονωθούν από ιστούς για καλλιέργεια ex vivo με διάφορους τρόπους. Μπορούν εύκολα να καθαριστούν από το αίμα, αλλά μόνο τα λευκά αιμοσφαίρια μπορούν να αναπτυχθούν σε καλλιέργεια. Τα κύτταρα μπορούννα απομονωθεί από στερεούς ιστούς με πέψη της εξωκυτταρικής μήτρας χρησιμοποιώντας ένζυμα όπως η κολλαγενάση, η θρυψίνη ή η προνάση πριν από την ανάδευση του ιστού για να απελευθερωθούν τα κύτταρα σε εναιώρημα. Εναλλακτικά, κομμάτια ιστού μπορούν να τοποθετηθούν σε μέσα ανάπτυξης και τα κύτταρα που αναπτύσσονται είναι διαθέσιμα για καλλιέργεια. Αυτή η μέθοδος είναι γνωστή ως καλλιέργεια μοσχευμάτων.
Κύτταρα που καλλιεργούνται απευθείας από το άτομο είναι γνωστά ως πρωτογενή κύτταρα. Με εξαίρεση ορισμένους που προέρχονται από όγκους, οι περισσότερες πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες έχουν περιορισμένη διάρκεια ζωής.
Αθάνατοι και βλαστοκύτταρα
Μια καθιερωμένη ή απαθανατισμένη κυτταρική σειρά έχει αποκτήσει την ικανότητα να αναπαράγεται επ' αόριστον, είτε μέσω τυχαίας μετάλλαξης είτε μέσω σκόπιμης τροποποίησης, όπως η τεχνητή έκφραση του γονιδίου της τελομεράσης. Πολλές κυτταρικές σειρές είναι ευρέως γνωστές ως τυπικοί τύποι κυττάρων.
Η μαζική καλλιέργεια ζωικών κυτταρικών σειρών είναι θεμελιώδης για την παραγωγή ιικών εμβολίων και άλλων προϊόντων βιοτεχνολογίας. Η καλλιέργεια ανθρώπινων βλαστοκυττάρων χρησιμοποιείται για την επέκταση του αριθμού τους και τη διαφοροποίηση των κυττάρων σε διαφορετικούς τύπους κατάλληλους για μεταμόσχευση. Η καλλιέργεια ανθρώπινων (βλαστικών) κυττάρων χρησιμοποιείται επίσης για τη συλλογή μορίων και εξωσωμάτων που απελευθερώνονται από βλαστοκύτταρα για θεραπευτικούς σκοπούς.
Σύνδεση με γενετική
Βιολογικά προϊόντα που παράγονται με τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA (rDNA) σε καλλιέργειες ζώων περιλαμβάνουνένζυμα, συνθετικές ορμόνες, ανοσοβιολογικούς (μονοκλωνικά αντισώματα, ιντερλευκίνες, λεμφοκίνες) και αντικαρκινικούς παράγοντες. Ενώ πολλές απλούστερες πρωτεΐνες μπορούν να παραχθούν χρησιμοποιώντας rDNA σε βακτηριακές καλλιέργειες, πιο σύνθετες πρωτεΐνες που είναι γλυκοσυλιωμένες (τροποποιημένες από υδατάνθρακες) πρέπει επί του παρόντος να παρασκευάζονται σε ζωικά κύτταρα.
Ένα σημαντικό παράδειγμα μιας τέτοιας πολύπλοκης πρωτεΐνης είναι η ορμόνη ερυθροποιητίνη. Το κόστος της καλλιέργειας κυτταροκαλλιεργειών θηλαστικών είναι υψηλό, επομένως η έρευνα βρίσκεται σε εξέλιξη για τη δημιουργία τέτοιων πολύπλοκων πρωτεϊνών σε κύτταρα εντόμων ή σε ανώτερα φυτά. Η χρήση μεμονωμένων εμβρυϊκών κυττάρων και σωματικών εμβρύων ως πηγή άμεσης μεταφοράς γονιδίων με βομβαρδισμό σωματιδίων, έκφραση παροδικών γονιδίων και συνεστιακή μικροσκοπία είναι μία από τις εφαρμογές του. Η καλλιέργεια φυτικών κυττάρων είναι η πιο κοινή μορφή αυτής της πρακτικής.
Ιστοκαλλιέργειες
Ιστοκαλλιέργεια είναι η καλλιέργεια ιστών ή κυττάρων που διαχωρίζονται από έναν οργανισμό. Αυτή η διαδικασία συνήθως διευκολύνεται χρησιμοποιώντας ένα υγρό, ημιστερεό ή στερεό μέσο ανάπτυξης όπως ζωμό ή άγαρ. Η ιστοκαλλιέργεια αναφέρεται γενικά στην καλλιέργεια ζωικών κυττάρων και ιστών, με τον πιο συγκεκριμένο όρο που χρησιμοποιείται για τα φυτά, την καλλιέργεια φυτικών κυττάρων και ιστών. Ο όρος "καλλιέργεια ιστών" επινοήθηκε από τον Αμερικανό παθολόγο Montrose Thomas Burroughs.
Ιστορικό ιστοκαλλιέργειας
Το 1885, ο Wilhelm Roux αφαίρεσε ένα τμήμα του μυελούπλάκες εμβρυϊκού κοτόπουλου και το διατήρησαν σε ζεστό αλατούχο διάλυμα για αρκετές ημέρες, καθιερώνοντας τη βασική αρχή της καλλιέργειας ιστών. Το 1907, ο ζωολόγος Ross Granville Harrison έδειξε την ανάπτυξη εμβρυϊκών κυττάρων βατράχου που θα οδηγούσαν σε νευρικά κύτταρα σε θρομβωμένη λέμφο. Το 1913, οι E. Steinhardt, C. Israel και R. A. Lambert καλλιέργησαν τον ιό της δαμαλίτιδας σε θραύσματα ιστού κέρατου ινδικού χοιριδίου. Ήταν ήδη κάτι πολύ πιο προηγμένο από την καλλιέργεια φυτικών κυττάρων.
Από το παρελθόν στο μέλλον
Ο Gotlieb Haberlandt ήταν ο πρώτος που επεσήμανε τη δυνατότητα καλλιέργειας απομονωμένων φυτικών ιστών. Πρότεινε ότι αυτή η μέθοδος θα μπορούσε να καθορίσει τις δυνατότητες μεμονωμένων κυττάρων μέσω της καλλιέργειας ιστών, καθώς και την αμοιβαία επιρροή των ιστών μεταξύ τους. Καθώς οι αρχικοί ισχυρισμοί του Haberland πραγματοποιήθηκαν, οι τεχνικές καλλιέργειας ιστών και κυττάρων άρχισαν να εφαρμόζονται ενεργά, οδηγώντας σε νέες ανακαλύψεις στη βιολογία και την ιατρική. Η αρχική του ιδέα, που παρουσιάστηκε το 1902, ονομάστηκε ολοκληρωτική ικανότητα: «Θεωρητικά, όλα τα φυτικά κύτταρα είναι ικανά να παράγουν ένα πλήρες φυτό». Η καλλιέργεια κυτταρικών καλλιεργειών εκείνη την εποχή προχώρησε δραματικά.
Στη σύγχρονη χρήση, η ιστοκαλλιέργεια αναφέρεται γενικά στην ανάπτυξη κυττάρων από τον ιστό ενός πολυκύτταρου οργανισμού in vitro. Οι συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας δεν είναι πολύ σημαντικές σε αυτή την περίπτωση. Αυτά τα κύτταρα μπορεί να απομονωθούν από έναν οργανισμό δότη, από πρωτογενή κύτταρα ή μια απαθανατισμένη κυτταρική σειρά. Τα κύτταρα πλένονταιένα μέσο καλλιέργειας που περιέχει τα θρεπτικά συστατικά και τις πηγές ενέργειας που είναι απαραίτητες για την επιβίωσή τους. Ο όρος "ιστοκαλλιέργεια" χρησιμοποιείται συχνά εναλλακτικά με την κυτταροκαλλιέργεια.
Αίτηση
Η κυριολεκτική σημασία της καλλιέργειας ιστού αναφέρεται στην καλλιέργεια κομματιών ιστού, δηλαδή καλλιέργεια μοσχευμάτων.
Η ιστοκαλλιέργεια είναι ένα σημαντικό εργαλείο για τη μελέτη της βιολογίας των κυττάρων από πολυκύτταρους οργανισμούς. Παρέχει ένα μοντέλο ιστού in vitro σε ένα καλά καθορισμένο περιβάλλον που μπορεί εύκολα να χειριστεί και να αναλυθεί.
Σε καλλιέργειες ζωικού ιστού, τα κύτταρα μπορούν να αναπτυχθούν ως μονοστιβάδες 2D (συμβατική καλλιέργεια) ή μέσα σε ινώδη ικριώματα ή πηκτές για να επιτευχθούν πιο φυσιοκρατικές τρισδιάστατες δομές που μοιάζουν με ιστούς (3D καλλιέργεια). Ο Eric Simon, σε μια έκθεση επιχορήγησης του NIH SBIR το 1988, έδειξε ότι η ηλεκτροϊνοποίηση θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή ικριωμάτων πολυμερών ινών σε κλίμακα νανο και υπομικρού, ειδικά σχεδιασμένα για χρήση ως υποστρώματα κυττάρων και ιστών in vitro.
Αυτή η πρώιμη χρήση ηλεκτρικά αγώγιμων πλεγμάτων ινών για κυτταροκαλλιέργεια και μηχανική ιστών έδειξε ότι διαφορετικοί τύποι κυττάρων θα προσκολλώνται και θα πολλαπλασιάζονται σε πολυανθρακικές ίνες. Έχει παρατηρηθεί ότι, σε αντίθεση με την πεπλατυσμένη μορφολογία που παρατηρείται συνήθως σε καλλιέργεια 2D, τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε ίνες ηλεκτρικού καλωδίου παρουσιάζουν μια πιο στρογγυλεμένη τρισδιάστατη μορφολογία που συνήθως εμφανίζεται σε ιστούς in vivo.
ΠολιτισμόςΟ φυτικός ιστός, ειδικότερα, σχετίζεται με την ανάπτυξη ολόκληρων φυτών από μικρά κομμάτια φυτικών ινών που καλλιεργούνται σε ένα μέσο.
Διαφορές στα μοντέλα
Η έρευνα στη μηχανική ιστών, τα βλαστοκύτταρα και τη μοριακή βιολογία περιλαμβάνει κυρίως την ανάπτυξη κυτταροκαλλιεργειών σε επίπεδα πλαστικά πιάτα. Αυτή η μέθοδος είναι γνωστή ως δισδιάστατη (2D) κυτταρική καλλιέργεια και αναπτύχθηκε για πρώτη φορά από τον Wilhelm Roux, ο οποίος το 1885 αφαίρεσε μέρος της μυελικής πλάκας ενός εμβρυϊκού κοτόπουλου και το κράτησε σε ζεστό φυσιολογικό ορό για αρκετές ημέρες σε επίπεδο γυαλί.
Από την πρόοδο της τεχνολογίας των πολυμερών, προέκυψε το σύγχρονο πρότυπο πλαστικό πιάτο για δισδιάστατη κυτταρική καλλιέργεια, κοινώς γνωστό ως τρυβλίο Petri. Ο Julius Richard Petri, ένας Γερμανός βακτηριολόγος, που συνήθως στην επιστημονική βιβλιογραφία αναφέρεται ως ο εφευρέτης αυτής της εφεύρεσης, εργάστηκε ως βοηθός του Robert Koch. Σήμερα, διάφοροι ερευνητές χρησιμοποιούν επίσης φιάλες καλλιέργειας, κώνους, ακόμη και σακούλες μιας χρήσης, όπως αυτές που χρησιμοποιούνται σε βιοαντιδραστήρες μιας χρήσης.
Εκτός από την καλλιέργεια καλά καθιερωμένων απαθανατισμένων κυτταρικών γραμμών, κύτταρα από πρωτογενή εκφυτεύματα πολλών οργανισμών μπορούν να καλλιεργηθούν για περιορισμένο χρονικό διάστημα μέχρι να εμφανιστεί ευαισθησία. Τα καλλιεργημένα πρωτογενή κύτταρα έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στην έρευνα, όπως στην περίπτωση των κερατοκυττάρων ψαριών σε μελέτες μετανάστευσης κυττάρων. Τα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας μπορούν να χρησιμοποιηθούν στα περισσότεραδιαφορετικό.
Οι καλλιέργειες φυτικών κυττάρων συνήθως αναπτύσσονται ως καλλιέργειες αιωρήματος κυττάρων σε υγρά μέσα ή σε καλλιέργειες τύλου σε στερεά μέσα. Η καλλιέργεια μη διαφοροποιημένων φυτικών κυττάρων και κάλλων απαιτεί σωστή ισορροπία των φυτικών αυξητικών ορμονών αυξίνη και κυτοκινίνη.
