Τι βασίζεται στον υβριδισμό του DNA; Αν και η δίκλωνη αλληλουχία DNA είναι γενικά σταθερή κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, η αλλαγή αυτών των συνθηκών στο εργαστήριο (συνήθως αυξάνοντας τη θερμοκρασία περιβάλλοντος) θα προκαλέσει τον διαχωρισμό των μορίων σε μεμονωμένες έλικες. Οι τελευταίες είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους, αλλά μπορεί επίσης να συμπληρώνουν άλλες αλληλουχίες που υπάρχουν στο περιβάλλον τους. Η μείωση της θερμοκρασίας περιβάλλοντος επιτρέπει στα μονόκλωνα μόρια να ανόπτονται ή να «υβριδοποιούνται» μεταξύ τους. Αυτή είναι η μέθοδος υβριδισμού DNA.
Η έννοια από τη σκοπιά της μοριακής βιολογίας
Επιστήμονες που ασχολούνται τόσο με την αντιγραφή του DNA όσο και με τη μεταγραφή του DNA σε RNA βασίζονται σε διασταυρώσεις νουκλεοτιδίων και τεχνικές μοριακής βιολογίας. Αυτό περιλαμβάνει κηλίδες Southern και Northern, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και τις περισσότερες προσεγγίσεις υβριδισμού και προσδιορισμού αλληλουχίας DNA-RNA.
Αίτηση
Ο υβριδισμός είναι η κύρια ιδιότητα του νουκλεοτιδίουαλληλουχίες και χρησιμοποιείται σε πολλές μεθόδους μοριακής βιολογίας. Η συνολική γενετική σχέση δύο ειδών μπορεί να προσδιοριστεί με υβριδισμό τμημάτων του DNA τους (υβριδισμός DNA-DNA). Λόγω των ομοιοτήτων αλληλουχίας μεταξύ των στενά συγγενών οργανισμών, απαιτείται υψηλότερη θερμοκρασία για την τήξη τέτοιων υβριδίων DNA σε σύγκριση με πιο απομακρυσμένους οργανισμούς. Διάφορες μέθοδοι χρησιμοποιούν υβριδισμό για τον προσδιορισμό της προέλευσης ενός δείγματος DNA, συμπεριλαμβανομένης της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Σε μια άλλη μέθοδο, σύντομες αλληλουχίες DNA υβριδοποιούνται σε κυτταρικό mRNA για να ταυτοποιηθούν τα εκφρασμένα γονίδια. Οι φαρμακευτικές εταιρείες διερευνούν τη χρήση αντιπληροφοριακού RNA για τη σύνδεση με ανεπιθύμητο mRNA, εμποδίζοντας το ριβόσωμα να μεταφράσει το mRNA σε πρωτεΐνη.
Ο
Υβριδισμός DNA-DNA αναφέρεται γενικά σε μια τεχνική μοριακής βιολογίας που μετρά τον βαθμό γενετικής ομοιότητας μεταξύ δεξαμενών αλληλουχιών DNA. Χρησιμοποιείται συνήθως για τον προσδιορισμό της γενετικής απόστασης μεταξύ δύο οργανισμών. Έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στη φυλογένεση και την ταξινόμηση.
Μεθοδολογία
Το
DNA από έναν οργανισμό επισημάνθηκε και στη συνέχεια αναμίχθηκε με μη επισημασμένο DNA που μπορούσε να συγκριθεί με αυτόν. Το μίγμα επωάζεται για να επιτραπεί στους κλώνους του DNA να διαχωριστούν και στη συνέχεια να ψυχθεί για να σχηματιστεί ένα αναγεννημένο υβριδικό δίκλωνο DNA. Οι υβριδοποιημένες αλληλουχίες με υψηλό βαθμό ομοιότητας θα συνδέονται πιο σφιχτά και θα απαιτούν περισσότερη ενέργεια για να διαχωριστούν: δηλαδή, διαχωρίζονται όταν θερμαίνονται σε υψηλότερηθερμοκρασία από ανόμοιες αλληλουχίες, μια διαδικασία γνωστή ως "τήξη DNA".
τήξη DNA
Αξιολογώντας το προφίλ τήξης του υβριδισμένου DNA, το δίκλωνο DNA συνδέεται σε μια λεγόμενη "στήλη" και το προκύπτον μίγμα θερμαίνεται. Σε κάθε βήμα, η στήλη πλένεται και οι αλληλουχίες DNA που τήκονται γίνονται μονόκλωνες και ξεπλένονται από τη στήλη. Οι θερμοκρασίες στις οποίες το επισημασμένο DNA εξέρχεται από τη στήλη αντικατοπτρίζει την ποσότητα ομοιότητας μεταξύ των αλληλουχιών (και το αυτοαναδιπλούμενο σχέδιο χρησιμεύει ως έλεγχος). Αυτά τα αποτελέσματα συνδυάζονται για να προσδιοριστεί ο βαθμός γενετικής ομοιότητας μεταξύ των οργανισμών. Σύμφωνα με τη σύγχρονη μικροβιολογία, ο υβριδισμός του DNA είναι αδύνατος χωρίς την κατανόηση αυτών των πραγμάτων.
Όταν πολλά είδη ριβονουκλεϊκού οξέος (ή δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος) συγκρίνονται με αυτόν τον τρόπο, οι τιμές ομοιότητας επιτρέπουν στο είδος να τοποθετηθεί στο φυλογενετικό δέντρο. Επομένως, αυτή είναι μια από τις πιθανές προσεγγίσεις για τη διεξαγωγή μοριακής συστηματικής. Οι Charles Sibley και John Ahlquist, οι πρωτοπόροι αυτής της τεχνικής, χρησιμοποίησαν υβριδισμό DNA-DNA για να μελετήσουν τις φυλογενετικές σχέσεις των πτηνών (ταξονομία Sibley-Ahlquist) και των πρωτευόντων.
Σημασία για τη βιολογία
Ο υβριδισμός DNA-DNA είναι το χρυσό πρότυπο για τη διάκριση βακτηριακών ειδών, με τιμή ομοιότητας μεγαλύτερη από 70%, υποδηλώνοντας ότι τα συγκριτικά στελέχη ανήκουν σε διαφορετικά είδη. Το 2014, προτάθηκε ένα όριο ομοιότητας 79% για τον διαχωρισμό ενός βακτηριακού υποείδους.
Οι κριτικοί υποστηρίζουν ότι η τεχνική είναι ανακριβής για τη σύγκριση στενά συγγενών ειδών, καθώς κάθε προσπάθεια μέτρησης των διαφορών μεταξύ ορθολογικών αλληλουχιών μεταξύ οργανισμών κατακλύζεται από τον υβριδισμό παράλογων αντίστοιχων στο γονιδίωμα ενός οργανισμού. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας DNA και οι υπολογιστικές συγκρίσεις αλληλουχιών είναι επί του παρόντος η ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τον προσδιορισμό της γενετικής απόστασης, αν και αυτή η προσέγγιση εξακολουθεί να χρησιμοποιείται στη μικροβιολογία για να βοηθήσει στον εντοπισμό βακτηρίων.
Ο τρέχων τρόπος είναι να διεξάγουμε υβριδισμό DNA-DNA σε σιλικόνη χρησιμοποιώντας πλήρως ή μερικώς αλληλουχημένα γονιδιώματα. Το GGDC που αναπτύχθηκε από το DSMZ είναι το πιο ακριβές γνωστό εργαλείο για τον υπολογισμό τιμών που μοιάζουν με DDH. Μεταξύ άλλων αλγοριθμικών βελτιώσεων, λύνει το πρόβλημα με παράλογες ακολουθίες φιλτράροντάς τις προσεκτικά από αντιστοιχίσεις μεταξύ δύο αλληλουχιών γονιδιώματος.
Μέθοδος FISH
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) είναι μια εργαστηριακή τεχνική που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση και την αλληλουχία του DNA, συχνά σε ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα.
Το 1969, ο Joseph Gall και η Mary Lou Pardu δημοσίευσαν μια εργασία που αποδεικνύει ότι ραδιενεργά αντίγραφα μιας ριβοσωμικής αλληλουχίας DNA θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση συμπληρωματικών αλληλουχιών DNA στον πυρήνα ενός αυγού βατράχου. Από αυτές τις αρχικές παρατηρήσεις, πολλές βελτιώσεις έχουν αυξήσει την ευελιξία καιη ευαισθησία της διαδικασίας σε τέτοιο βαθμό που ο in situ υβριδισμός («in place», λατινικά) θεωρείται πλέον σημαντικό εργαλείο στην κυτταρογενετική. (Ο όρος in situ χρησιμοποιείται τώρα επίσης για να αναφέρεται στο αρχικό στάδιο ανάπτυξης καρκινώματος, όταν μόνο ο επιθηλιακός ιστός εμπλέκεται στην παθολογική διαδικασία.)
Ακολουθία υβριδισμού φθορισμού
Οι ανιχνευτές
RNA μπορούν να σχεδιαστούν για οποιοδήποτε γονίδιο ή οποιαδήποτε αλληλουχία μέσα σε ένα γονίδιο για την οπτικοποίηση του lncRNA και του mRNA του miRNA σε ιστούς και κύτταρα. Το FISH χρησιμοποιείται με τη μελέτη του κύκλου αναπαραγωγής των κυττάρων, ιδιαίτερα της πυρηνικής μεσοφάσεως για τυχόν χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Το FISH σάς επιτρέπει να αναλύσετε μια μεγάλη σειρά αρχειακών περιπτώσεων, είναι πολύ πιο εύκολο να αναγνωρίσετε το ταυτοποιημένο χρωμόσωμα δημιουργώντας έναν ανιχνευτή με μια τεχνητή βάση χρωμοσώματος που θα προσελκύει παρόμοια χρωμοσώματα.
Σήματα υβριδισμού για κάθε ανιχνευτή όταν ανιχνεύεται πυρηνική ανωμαλία: κάθε ανιχνευτής ανίχνευσης mRNA και lncRNA αποτελείται από 20 ζεύγη ολιγονουκλεοτιδίων, κάθε ζεύγος καλύπτει χώρο 40-50 bp. σ. Οι ανιχνευτές χρησιμοποιούν αποκλειστική χημεία για την ανίχνευση mRNA.
Υβριδισμός με ανιχνευτές DNA
Οι ανιχνευτές κατασκευάζονται συχνά από θραύσματα DNA που έχουν απομονωθεί, καθαριστεί και ενισχυθεί για χρήση στο σχεδιασμό του ανθρώπινου γονιδιώματος. Το μέγεθος του ανθρώπινου γονιδιώματος είναι τόσο μεγάλο σε σύγκριση με το μήκος που μπορεί να προσδιοριστεί άμεσα η αλληλουχία του που είναι απαραίτητο να το χωρίσουμε σεθραύσματα. Τελικά, αυτά τα θραύσματα ταξινομήθηκαν με πέψη ενός αντιγράφου κάθε θραύσματος σε ακόμη μικρότερες μονάδες χρησιμοποιώντας ενδονουκλεάσες ειδικές για την αλληλουχία για τη μέτρηση του μεγέθους κάθε μικρού θραύσματος χρησιμοποιώντας χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους χρησιμοποιώντας αυτές τις πληροφορίες για να προσδιοριστεί πού επικαλύπτονται τα μεγάλα θραύσματα μεταξύ τους..
Για να διατηρηθούν τα στοιχεία με τις μεμονωμένες αλληλουχίες DNA τους, τα θραύσματα προστέθηκαν σε ένα σύστημα συνεχώς επαναλαμβανόμενων βακτηριακών πληθυσμών. Κλωνικοί πληθυσμοί βακτηρίων, κάθε πληθυσμός που διατηρεί ένα μόνο τεχνητό χρωμόσωμα, αποθηκεύονται σε διάφορα εργαστήρια σε όλο τον κόσμο. Τα τεχνητά χρωμοσώματα (BAC) μπορούν να αναπτυχθούν, να εξαχθούν και να επισημανθούν σε οποιοδήποτε εργαστήριο που περιέχει βιβλιοθήκη. Οι γονιδιωματικές βιβλιοθήκες ονομάζονται συχνά από τα ιδρύματα όπου αναπτύχθηκαν. Ένα παράδειγμα είναι η βιβλιοθήκη RPCI-11, που πήρε το όνομά της από το Roswell Cancer Institute στο Μπάφαλο (Νέα Υόρκη, ΗΠΑ). Αυτά τα θραύσματα αποτελούν περίπου 100 χιλιάδες ζεύγη βάσεων και αποτελούν τη βάση των περισσότερων ανιχνευτών FISH.
