Η σύγχρονη βιολογία εκπλήσσει με τη μοναδικότητα και την κλίμακα των ανακαλύψεών της. Σήμερα, αυτή η επιστήμη μελετά τις περισσότερες από τις διαδικασίες που κρύβονται από τα μάτια μας. Αυτό είναι αξιοσημείωτο για τη μοριακή βιολογία - έναν από τους πολλά υποσχόμενους τομείς που βοηθά στην αποκάλυψη των πιο περίπλοκων μυστηρίων της ζωντανής ύλης.
Τι είναι η αντίστροφη μεταγραφή
Η αντίστροφη μεταγραφή (RT για συντομία) είναι μια ειδική διαδικασία χαρακτηριστική των περισσότερων ιών RNA. Το κύριο χαρακτηριστικό του είναι η σύνθεση ενός μορίου δίκλωνου DNA που βασίζεται σε αγγελιοφόρο RNA.
Το ΟΤ δεν είναι χαρακτηριστικό των βακτηρίων ή των ευκαρυωτικών οργανισμών. Το κύριο ένζυμο, η ρεβερσετάση, παίζει βασικό ρόλο στη σύνθεση του δίκλωνου DNA.
Ιστορικό ανακάλυψης
Η ιδέα ότι ένα μόριο ριβονουκλεϊκού οξέος θα μπορούσε να γίνει πρότυπο για τη σύνθεση του DNA θεωρούνταν παράλογη μέχρι τη δεκαετία του 1970. Στη συνέχεια, η B altimore και ο Temin, δουλεύοντας χωριστά ο ένας από τον άλλο, ανακάλυψαν σχεδόν ταυτόχρονα ένα νέο ένζυμο. Το ονόμασαν RNA-εξαρτώμενο-DNA πολυμεράση ή αντίστροφη μεταγραφάση.
Η ανακάλυψη αυτού του ενζύμου επιβεβαίωσε άνευ όρων την ύπαρξη οργανισμώνικανό για αντίστροφη μεταγραφή. Και οι δύο επιστήμονες έλαβαν το βραβείο Νόμπελ το 1975. Μετά από κάποιο χρονικό διάστημα, ο Engelhardt πρότεινε ένα εναλλακτικό όνομα για την ανάστροφη μεταγραφάση - revertase.
Γιατί το OT έρχεται σε αντίθεση με το κεντρικό δόγμα της μοριακής βιολογίας
Το Κεντρικό Δόγμα είναι η έννοια της διαδοχικής πρωτεϊνικής σύνθεσης σε οποιοδήποτε ζωντανό κύτταρο. Ένα τέτοιο σχήμα αποτελείται από τρία συστατικά: DNA, RNA και πρωτεΐνη.
Σύμφωνα με το κεντρικό δόγμα, το RNA μπορεί να συντεθεί αποκλειστικά στο πρότυπο DNA και μόνο τότε το RNA εμπλέκεται στην κατασκευή της πρωτογενούς δομής της πρωτεΐνης.
Αυτό το δόγμα έγινε επίσημα αποδεκτό στην επιστημονική κοινότητα πριν από την ανακάλυψη της αντίστροφης μεταγραφής. Δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι η ιδέα της αντίστροφης σύνθεσης DNA από RNA έχει απορριφθεί εδώ και καιρό από τους επιστήμονες. Μόνο το 1970, μαζί με την ανακάλυψη της ρεβερσετάσης, τέθηκε ένα τέλος σε αυτό το ζήτημα, το οποίο αντικατοπτρίστηκε στην έννοια της πρωτεϊνοσύνθεσης.
Revertase ρετροϊών πτηνών
Η διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής δεν είναι πλήρης χωρίς τη συμμετοχή της εξαρτώμενης από RNA πολυμεράσης DNA. Η ρεβερτάση του ρετροϊού των πτηνών έχει μελετηθεί στο μέγιστο βαθμό μέχρι σήμερα.
Μόνο περίπου 40 μόρια αυτής της πρωτεΐνης μπορούν να βρεθούν σε ένα ιοσωμάτιο αυτής της οικογένειας ιών. Η πρωτεΐνη αποτελείται από δύο υπομονάδες που είναι σε ίσους αριθμούς και εκτελούν τρεις σημαντικές λειτουργίες της αναστροφής:
1) Σύνθεση ενός μορίου DNA τόσο σε μονόκλωνο/δίκλωνο πρότυπο RNA όσο και με βάση δεοξυριβονουκλεϊκά οξέα.
2) Ενεργοποίηση RNase H, ο κύριος ρόλος της οποίας είναι ναδιάσπαση του μορίου RNA στο σύμπλεγμα RNA-DNA.
3) Καταστροφή τμημάτων μορίων DNA για εισαγωγή στο ευκαρυωτικό γονιδίωμα.
Μηχανισμός OT
Τα βήματα της αντίστροφης μεταγραφής μπορεί να διαφέρουν ανάλογα με την οικογένεια των ιών, π.χ. σχετικά με τον τύπο των νουκλεϊκών οξέων τους.
Ας εξετάσουμε πρώτα εκείνους τους ιούς που χρησιμοποιούν reversetase. Εδώ η διαδικασία OT χωρίζεται σε 3 βήματα:
1) Σύνθεση του κλώνου RNA "-" στο πρότυπο "+" του κλώνου RNA.
2) Καταστροφή του κλώνου "+" του RNA στο σύμπλεγμα RNA-DNA χρησιμοποιώντας το ένζυμο RNase H.
3) Σύνθεση ενός μορίου δίκλωνου DNA στο εκμαγείο "-" της αλυσίδας RNA.
Αυτή η μέθοδος αναπαραγωγής ιοσωμάτων είναι χαρακτηριστική για ορισμένους ογκογόνους ιούς και τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV).
Αξίζει να σημειωθεί ότι για τη σύνθεση οποιουδήποτε νουκλεϊκού οξέος σε ένα πρότυπο RNA, απαιτείται σπόρος ή εκκινητής. Ένας εκκινητής είναι μια σύντομη αλληλουχία νουκλεοτιδίων που είναι συμπληρωματική προς το 3' άκρο ενός μορίου RNA (πρότυπο) και παίζει σημαντικό ρόλο στην έναρξη της σύνθεσης.
Όταν έτοιμα δίκλωνα μόρια DNA ιικής προέλευσης ενσωματωθούν στο ευκαρυωτικό γονιδίωμα, ξεκινά ο συνήθης μηχανισμός σύνθεσης πρωτεΐνης ιοσωμάτων. Ως αποτέλεσμα, το κύτταρο που «συλλαμβάνεται» από τον ιό μετατρέπεται σε εργοστάσιο παραγωγής ιοσωμάτων, όπου σχηματίζονται σε μεγάλες ποσότητες τα απαραίτητα μόρια πρωτεΐνης και RNA.
Ένας άλλος τρόπος αντίστροφης μεταγραφής βασίζεται στη δράση της συνθετάσης RNA. Αυτή η πρωτεΐνη είναι ενεργή σε παραμυξοϊούς, ραβδοϊούς, πικορνοϊούς. Σε αυτή την περίπτωση, δεν υπάρχει τρίτο στάδιο του ΟΤ - ο σχηματισμόςδίκλωνο DNA, και αντ' αυτού, συντίθεται μια αλυσίδα RNA "+" στο πρότυπο της αλυσίδας RNA "-" του ιού και αντίστροφα.
Η επανάληψη τέτοιων κύκλων οδηγεί τόσο στην αντιγραφή του γονιδιώματος του ιού όσο και στον σχηματισμό mRNA ικανού για σύνθεση πρωτεϊνών υπό τις συνθήκες ενός μολυσμένου ευκαρυωτικού κυττάρου.
Βιολογική σημασία της αντίστροφης μεταγραφής
Η διαδικασία OT είναι υψίστης σημασίας στον κύκλο ζωής πολλών ιών (κυρίως ρετροϊών όπως ο HIV). Το RNA ενός βιριόντος που επιτέθηκε σε ένα ευκαρυωτικό κύτταρο γίνεται πρότυπο για τη σύνθεση του πρώτου κλώνου DNA, στον οποίο δεν είναι δύσκολο να ολοκληρωθεί ο δεύτερος κλώνος.
Το ληφθέν δίκλωνο DNA του ιού ενσωματώνεται στο ευκαρυωτικό γονιδίωμα, γεγονός που οδηγεί στην ενεργοποίηση των διαδικασιών σύνθεσης πρωτεΐνης ιοσωματίου και στην εμφάνιση μεγάλου αριθμού αντιγράφων του μέσα στο μολυσμένο κύτταρο. Αυτή είναι η κύρια αποστολή του Revertase και γενικά του OT για τον ιό.
Η αντίστροφη μεταγραφή μπορεί επίσης να συμβεί σε ευκαρυώτες στο πλαίσιο των ρετροτρανσποζονίων - κινητών γενετικών στοιχείων που μπορούν ανεξάρτητα να μεταφέρουν από το ένα μέρος του γονιδιώματος στο άλλο. Τέτοια στοιχεία, σύμφωνα με τους επιστήμονες, προκάλεσαν την εξέλιξη των ζωντανών οργανισμών.
Το ρετροτρανσποζόνιο είναι ένα τμήμα ευκαρυωτικού DNA που κωδικοποιεί αρκετές πρωτεΐνες. Ένα από αυτά, η ρεβερσετάση, εμπλέκεται άμεσα στον αποτοπισμό μιας τέτοιας ρετροτρανσποροζόνης.
Χρήση του OT στην επιστήμη
Από τη στιγμή που η ρεβερσετάση απομονώθηκε στην καθαρή της μορφή, η διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής υιοθετήθηκε από τους βιολόγους. Η μελέτη του μηχανισμού OT εξακολουθεί να βοηθά στην ανάγνωση των αλληλουχιών των πιο σημαντικών ανθρώπινων πρωτεϊνών.
Το γεγονός είναι ότι το γονιδίωμα των ευκαρυωτών, συμπεριλαμβανομένου και εμάς, περιέχει μη ενημερωτικές περιοχές που ονομάζονται ιντρόνια. Όταν διαβάζεται μια νουκλεοτιδική αλληλουχία από τέτοιο DNA και σχηματίζεται ένα μονόκλωνο RNA, το τελευταίο χάνει εσώνια και κωδικοποιεί αποκλειστικά για πρωτεΐνη. Εάν το DNA συντίθεται χρησιμοποιώντας ρεβερσετάση σε ένα πρότυπο RNA, τότε είναι εύκολο να προσδιοριστεί η αλληλουχία του και να βρεθεί η σειρά των νουκλεοτιδίων.
Νουκλεϊκό οξύ που έχει σχηματιστεί από την αντίστροφη μεταγραφάση ονομάζεται cDNA. Συχνά χρησιμοποιείται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για την τεχνητή αύξηση του αριθμού αντιγράφων του προκύπτοντος αντιγράφου cDNA. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται όχι μόνο στην επιστήμη, αλλά και στην ιατρική: οι εργαστηριακοί βοηθοί καθορίζουν την ομοιότητα αυτού του DNA με τα γονιδιώματα διαφόρων βακτηρίων ή ιών από μια κοινή βιβλιοθήκη. Η σύνθεση φορέων και η εισαγωγή τους στα βακτήρια είναι ένας από τους πολλά υποσχόμενους τομείς της βιολογίας. Εάν το RT χρησιμοποιείται για το σχηματισμό του DNA ανθρώπων και άλλων οργανισμών χωρίς εσώνια, τέτοια μόρια μπορούν εύκολα να εισαχθούν στο βακτηριακό γονιδίωμα. Έτσι τα τελευταία γίνονται εργοστάσια για την παραγωγή ουσιών απαραίτητων για έναν άνθρωπο (για παράδειγμα, ένζυμα).
