Η χρώση
Gram χρησιμοποιείται ευρέως στη μικροβιολογία καθώς είναι ένας από τους ευκολότερους τρόπους διαφοροποίησης των βακτηρίων με βάση τη σύνθεση του κυτταρικού τους τοιχώματος. Σύμφωνα με το Gram, όλα τα βακτήρια μπορούν να χωριστούν σε gram-θετικά (Gram (+)) και Gram-αρνητικά (Gram (-)). Η μέθοδος χρώσης Gram αναπτύχθηκε το 1884 και δεν έχει χάσει τη δημοτικότητά της από τότε, αν και έχει τροποποιηθεί αρκετές φορές.
Δομή κυτταρικού τοιχώματος
Η χρώση κατά Gram αποκαλύπτει εάν ένα βακτήριο είναι Gram-θετικό ή Gram-αρνητικό. Η διαίρεση των βακτηρίων σε Gram (+) και Gram (-) πραγματοποιείται σύμφωνα με τη δομή του κυτταρικού τους τοιχώματος.
Το κυτταρικό τοίχωμα περιέχει τη μεγαλύτερη ποσότητα πεπτιδογλυκάνης (μουρεΐνη) - μια πολύπλοκη ουσία, η οποία περιλαμβάνει πεπταπεπτίδιο και γλυκάνη. Η γλυκάνη αποτελείται από εναλλασσόμενα υπολείμματα Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης και Ν-ακετυλομουραμικού οξέος που συνδέονται μεταξύ τους με β-1,4-γλυκοσιδικοί δεσμοί. Η πεπτιδογλυκάνη παρέχει διατήρηση του σχήματος των κυττάρων, οσμωτική προστασία και αντιγονικές λειτουργίες.
Κύριες διαφορές μεταξύ θετικών και αρνητικών κατά Gram βακτηρίων
Διαφορετικά βακτήρια έχουν διαφορετικό πάχος στιβάδας πεπτιδογλυκάνης. Στα βακτήρια που ταξινομούνται ως gram-θετικά κυμαίνεται από 15 έως 80 nm, ενώ στα gram-αρνητικά είναι από 2 έως 8 nm. Ταυτόχρονα, τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια έχουν μια ειδική δομή κάτω από το στρώμα πεπτιδογλυκάνης, την οποία δεν έχουν τα θετικά κατά Gram βακτήρια - τον περιπλασματικό χώρο. Αυτός ο χώρος είναι γεμάτος με υδρολυτικά ένζυμα - β-λακταμάση, ριβονουκλεάση 1, φωσφατάση. Αυτά τα ένζυμα είναι υπεύθυνα για την αντίσταση των Gram-αρνητικών βακτηρίων σε πολλά αντιβιοτικά.
Το στρώμα Gram(-) πεπτιδογλυκάνης των βακτηρίων συνδέεται με λιποπολυσακχαρίτη, μια αντιγονική δομή που περιέχει ενδοτοξίνη. Στα Gram(+) βακτήρια, τα τεϊχοϊκά οξέα εκτελούν παρόμοιες λειτουργίες.
Τα Gram-αρνητικά βακτήρια έχουν μια πρόσθετη δομή - την εξωτερική μεμβράνη.
Η ουσία της μεθόδου χρώσης
Πριν ξεκινήσετε τη χρώση, παρασκευάζονται επιχρίσματα των μελετηθέντων βακτηρίων. Για να γίνει αυτό, το νερό στάζει σε μια γυάλινη πλάκα και μια καλλιέργεια μικροοργανισμών προστίθεται εκεί με έναν βακτηριακό βρόχο. Στη συνέχεια, αφού στεγνώσει τελείως το νερό, το επίχρισμα στερεώνεται - η γυάλινη πλάκα μεταφέρεται πολλές φορές πάνω από τη φλόγα του καυστήρα. Η χρώση κατά Gram είναι πιο αποτελεσματική από τη χρώση ζωντανών βακτηρίων - τα μόρια της χρωστικής συνδέονται καλύτερα με τα νεκρά κύτταρα.
Ο χρωματισμός γίνεται σε διάφορα στάδια:
- Μικρά κομμάτια διηθητικού χαρτιού τοποθετούνται σε ένα σταθερό επίχρισμα και χύνεται η κύρια βαφή - βιολετί γεντιανής ή μπλε του μεθυλενίου.
- Μετά από 3-5 λεπτά, αφαιρέστε το έγχρωμο διηθητικό χαρτί και γεμίστε το επίχρισμα με διάλυμα Lugol για 1 λεπτό. Σε αυτή την περίπτωση, το σκεύασμα σκουραίνει.
- Το διάλυμα Lugol στραγγίζεται και το επίχρισμα υποβάλλεται σε επεξεργασία με καθαρή αιθυλική αλκοόλη: μερικές σταγόνες στάζουν πάνω στο παρασκεύασμα και στραγγίζονται μετά από 20 δευτερόλεπτα. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται 2-3 φορές.
- Ξπλύνετε τη δοκιμαστική πλάκα με απεσταγμένο νερό.
- Παράγετε επιπλέον χρώση - τελειώστε την προετοιμασία με φούξιν. Μετά από 1-2 λεπτά, η βαφή ξεπλένεται.
- Αφού το νερό στεγνώσει, εξετάστε το επίχρισμα στο μικροσκόπιο. Τα Gram-θετικά βακτήρια θα είναι μπλε-ιώδες, τα Gram-αρνητικά βακτήρια θα είναι ροζ ή κόκκινα.
Αιτίες διαφορετικών μοτίβων χρώσης
Όπως περιγράφηκε παραπάνω, η χρώση κατά Gram βακτηρίων χρωματίζει τα θετικά κατά Gram βακτήρια μπλε-ιώδες, ενώ τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια βάφονται κόκκινο ή ροζ. Ο λόγος για τη διαφορική χρώση των βακτηρίων με αυτή τη μέθοδο είναι ότι αφού η διαλυτή μορφή της βιολέτας γεντιανής εισέλθει στο κύτταρο, η χρωστική περνά στην αδιάλυτη μορφή ιωδίου. Κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας βακτηρίων με αιθυλική αλκοόλη, τα λιπίδια εξάγονται από τη μεμβράνη υπό τη δράση αυτού του μη πολικού διαλύτη. Η μεμβράνη στη συνέχεια γίνεται πορώδης και δεν αποτελεί πλέον σημαντικό εμπόδιο για την έκπλυση της βαφής. ΩστόσοΗ πεπτιδογλυκάνη είναι πιο ανθεκτική σε μη πολικούς διαλύτες, συμπεριλαμβανομένου του αλκοόλ. Είναι αυτός που εμποδίζει την έκπλυση της βαφής, έτσι τα βακτήρια με παχύ στρώμα μουρεΐνης γίνονται μπλε-ιώδες (θετικά κατά gram) και μετά από θεραπεία με οινόπνευμα δεν αλλάζουν το χρώμα τους.
Λεπτό στρώμα μουρεΐνης αρνητικών gram βακτηρίων δεν μπορεί να συγκρατήσει τα μόρια της χρωστικής στο κύτταρο, έτσι μετά τη δράση του αλκοόλ γίνονται άχρωμα - κηλίδες gram-αρνητικά.
Μετά την έκθεση ενός επιχρίσματος σε φούξινη, τα βαμμένα με Gram βακτήρια παραμένουν μπλε-ιώδες, ενώ τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια γίνονται ροζ-κόκκινα.
Παραδείγματα βακτηρίων Gram(+) και Gram(-)
Τα Gram-αρνητικά βακτήρια περιλαμβάνουν κυανοβακτήρια, βακτήρια θείου, βακτήρια σιδήρου, χλαμύδια, ρικέτσια, οξικά βακτήρια, πολλά μεθυλοβακτήρια, θειονικά βακτήρια, αρσενιτοβακτήρια, καρβοξυβακτήρια.
Bifidobacteria, πολλά υδρόβια βακτήρια, στρεπτόκοκκοι και σταφυλόκοκκοι είναι θετικοί κατά Gram.
