Οι μέθοδοι μοριακής βιολογικής έρευνας παίζουν μεγάλο ρόλο στη σύγχρονη ιατρική, την ιατροδικαστική και τη βιολογία. Χάρη στην πρόοδο στη μελέτη του DNA και του RNA, ένα άτομο είναι σε θέση να μελετήσει το γονιδίωμα ενός οργανισμού, να προσδιορίσει τον αιτιολογικό παράγοντα μιας ασθένειας, να αναγνωρίσει το επιθυμητό νουκλεϊκό οξύ σε ένα μείγμα οξέων κ.λπ.
Μέθοδοι μοριακής βιολογικής έρευνας. Τι είναι;
Πίσω στις δεκαετίες του '70 και του '80, οι επιστήμονες κατάφεραν για πρώτη φορά να αποκρυπτογραφήσουν το ανθρώπινο γονιδίωμα. Αυτό το γεγονός έδωσε ώθηση στην ανάπτυξη της γενετικής μηχανικής και της μοριακής βιολογίας. Η μελέτη των ιδιοτήτων του DNA και του RNA οδήγησε στο γεγονός ότι είναι πλέον δυνατή η χρήση αυτών των νουκλεϊκών οξέων για τη διάγνωση μιας ασθένειας, μελέτη γονιδίων.
Λήψη DNA και RNA
Οι μοριακές βιολογικές διαγνωστικές μέθοδοι απαιτούν την παρουσία αρχικού υλικού: πιο συχνά είναι νουκλεϊκά οξέα. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι για να απομονωθούν αυτές οι ουσίες από τα κύτταρα των ζωντανών οργανισμών. Κάθε ένα από αυτά έχει τα δικά του πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα, και είναι απαραίτητολάβετε υπόψη κατά την επιλογή μιας μεθόδου για την απομόνωση καθαρών νουκλεϊκών οξέων.
1. Λήψη DNA σύμφωνα με το Marmur. Η μέθοδος συνίσταται στην επεξεργασία ενός μείγματος ουσιών με αλκοόλ, ως αποτέλεσμα της οποίας καθιζάνει καθαρό DNA. Το μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι η χρήση επιθετικών ουσιών: φαινόλη και χλωροφόρμιο.
2. Απομόνωση DNA σύμφωνα με τον Boom. Η κύρια ουσία που χρησιμοποιείται εδώ είναι η θειοκυανική γουανιδίνη (GuSCN). Συμβάλλει στην καθίζηση του δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος σε εξειδικευμένα υποστρώματα, από τα οποία μπορεί στη συνέχεια να συλλεχθεί χρησιμοποιώντας ειδικό ρυθμιστικό διάλυμα. Ωστόσο, το GuSCN είναι ένας αναστολέας του PTC και ακόμη και ένα μικρό μέρος του που εισέρχεται στο κατακρημνισμένο DNA μπορεί να επηρεάσει την πορεία της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στη συνεργασία με τα νουκλεϊκά οξέα.
3. Καθίζηση ακαθαρσιών. Η μέθοδος διαφέρει από τις προηγούμενες στο ότι δεν κατακρημνίζονται τα μόρια του δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος, αλλά οι ακαθαρσίες. Για να γίνει αυτό, χρησιμοποιούνται ιονανταλλάκτες. Το μειονέκτημα είναι ότι δεν μπορούν να καθιζάνουν όλες οι ουσίες.
4. Μαζικός έλεγχος. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις όπου δεν χρειάζονται ακριβείς πληροφορίες για τη σύνθεση του μορίου DNA, αλλά είναι απαραίτητο να ληφθούν ορισμένα στατιστικά δεδομένα. Αυτό εξηγείται από το γεγονός ότι η δομή του νουκλεϊκού οξέος μπορεί να καταστραφεί κατά την επεξεργασία με απορρυπαντικά, ιδιαίτερα αλκάλια.
Ταξινόμηση μεθόδων έρευνας
Όλες οι μέθοδοι μοριακής βιολογικής έρευνας χωρίζονται σε τρεις μεγάλες ομάδες:
1. Ενίσχυση (με χρήση πολλών ενζύμων). Εδώαναφέρεται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης - PCR, η οποία παίζει μεγάλο ρόλο σε πολλές από τις διαγνωστικές μεθόδους.
2. Μη ενισχυτικό. Αυτή η ομάδα μεθόδων σχετίζεται άμεσα με τη λειτουργία μειγμάτων νουκλεϊκών οξέων. Παραδείγματα είναι 3 κηλίδες, in situ υβριδισμός κ.λπ.
3. Μέθοδοι που βασίζονται στην αναγνώριση ενός σήματος από ένα μόριο ανιχνευτή που συνδέεται με ένα συγκεκριμένο DNA ή RNA ανιχνευτή. Ένα παράδειγμα είναι το Hybride Capture System (hc2).
Ένζυμα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε ερευνητικές μεθόδους μοριακής βιολογίας
Πολλές μοριακές διαγνωστικές μέθοδοι περιλαμβάνουν τη χρήση ενός ευρέος φάσματος ενζύμων. Παρακάτω είναι τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα:
1. Ένζυμο περιορισμού - «κόβει» το μόριο DNA στα απαραίτητα μέρη.
2. DNA πολυμεράση - συνθέτει ένα δίκλωνο μόριο δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος.
3. Αντίστροφη μεταγραφάση (ρεβερτάση) - χρησιμοποιείται για τη σύνθεση DNA σε πρότυπο RNA.
4. DNA λιγάση - υπεύθυνη για το σχηματισμό φωσφοδιεστερικών δεσμών μεταξύ νουκλεοτιδίων.
5. Εξωνουκλεάση - αφαιρεί νουκλεοτίδια από τα τερματικά τμήματα του μορίου δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος.
Η PCR είναι η κύρια μέθοδος ενίσχυσης του DNA
Αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιείται ενεργά στη σύγχρονη μοριακή βιολογία. Αυτή είναι μια μέθοδος κατά την οποία ένας τεράστιος αριθμός αντιγράφων μπορεί να ληφθεί από ένα μόνο μόριο DNA (τα μόρια ενισχύονται).
Κύριες λειτουργίες της PCR:
- διαγνωστικάασθένειες;
- κλωνοποίηση τμημάτων DNA, γονιδίων.
Τα ακόλουθα στοιχεία απαιτούνται για την πραγματοποίηση μιας αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης: το αρχικό μόριο DNA, μια θερμοσταθερή πολυμεράση DNA (Taq ή Pfu), φωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (πηγές αζωτούχων βάσεων), εκκινητές (2 εκκινητές ανά 1 μόριο DNA) και το ίδιο το buffer system, στο οποίο είναι δυνατές όλες οι αντιδράσεις.
Η PCR αποτελείται από τρία στάδια: μετουσίωση, ανόπτηση εκκινητή και επιμήκυνση.
1. Μετουσίωσης. Σε θερμοκρασία 94-95 βαθμών Κελσίου, οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των δύο κλώνων του DNA σπάνε και ως αποτέλεσμα παίρνουμε δύο μονόκλωνα μόρια.
2. Αστάρι ανόπτησης. Σε θερμοκρασία 50-60 βαθμών Κελσίου, οι εκκινητές συνδέονται στα άκρα των μονόκλωνων μορίων νουκλεϊκού οξέος με τον τύπο της συμπληρωματικότητας.
3. Επιμήκυνση. Σε θερμοκρασία 72 βαθμών, λαμβάνει χώρα η σύνθεση θυγατρικών δίκλωνων μορίων δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος.
Αλληλουχία DNA
Οι μέθοδοι μοριακής βιολογικής έρευνας συχνά απαιτούν γνώση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων σε ένα μόριο δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος. Η αλληλουχία πραγματοποιείται για τον προσδιορισμό του γενετικού κώδικα. Η μοριακή διάγνωση του μέλλοντος θα βασίζεται στη γνώση που αποκτάται από την ανθρώπινη αλληλουχία.
Διακρίνονται οι ακόλουθοι τύποι αλληλουχίας:
- Αλληλουχία Maxam-Gilbert;
- Sanger sequencing;
- pyrosequencing;
- νανοπόροςαλληλουχία.
