Η πρωτεΐνη είναι απαραίτητο συστατικό όλων των οργανισμών. Κάθε μόριό του αποτελείται από μία ή περισσότερες πολυπεπτιδικές αλυσίδες που αποτελούνται από αμινοξέα. Αν και οι πληροφορίες που είναι απαραίτητες για τη ζωή κωδικοποιούνται σε DNA ή RNA, οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες εκτελούν ένα ευρύ φάσμα βιολογικών λειτουργιών στους οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένης της ενζυματικής κατάλυσης, της προστασίας, της υποστήριξης, της κίνησης και της ρύθμισης. Ανάλογα με τις λειτουργίες τους στον οργανισμό, αυτές οι ουσίες μπορούν να χωριστούν σε διάφορες κατηγορίες, όπως αντισώματα, ένζυμα, δομικό συστατικό. Δεδομένων των σημαντικών λειτουργιών τους, τέτοιες ενώσεις έχουν μελετηθεί εντατικά και χρησιμοποιούνται ευρέως.
Στο παρελθόν, ο κύριος τρόπος απόκτησης μιας ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ήταν η απομόνωσή της από μια φυσική πηγή, η οποία συνήθως είναι αναποτελεσματική και χρονοβόρα. Οι πρόσφατες εξελίξεις στη βιολογική μοριακή τεχνολογία κατέστησαν δυνατή την κλωνοποίηση DNA που κωδικοποιεί ένα συγκεκριμένο σύνολο ουσιών σε φορέα έκφρασης για ουσίες όπως βακτήρια, ζυμομύκητες, κύτταρα εντόμων και κύτταρα θηλαστικών.
Με απλά λόγια, οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες μεταφράζονται από εξωγενή προϊόντα DNA σεζωντανά κύτταρα. Η απόκτησή τους συνήθως περιλαμβάνει δύο βασικά βήματα:
- Κλωνοποίηση μορίου.
- Έκφραση πρωτεΐνης.
Επί του παρόντος, η παραγωγή μιας τέτοιας δομής είναι μια από τις πιο ισχυρές μεθόδους που χρησιμοποιούνται στην ιατρική και τη βιολογία. Η σύνθεση έχει ευρεία εφαρμογή στην έρευνα και τη βιοτεχνολογία.
Ιατρική κατεύθυνση
Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες παρέχουν σημαντικές θεραπείες για διάφορες ασθένειες όπως ο διαβήτης, ο καρκίνος, οι μολυσματικές ασθένειες, η αιμορροφιλία και η αναιμία. Τυπικές συνθέσεις τέτοιων ουσιών περιλαμβάνουν αντισώματα, ορμόνες, ιντερλευκίνες, ένζυμα και αντιπηκτικά. Υπάρχει μια αυξανόμενη ανάγκη για ανασυνδυασμένες συνθέσεις για θεραπευτική χρήση. Σας επιτρέπουν να επεκτείνετε τις μεθόδους θεραπείας.
Γενετικά τροποποιημένες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην αγορά των θεραπευτικών φαρμάκων. Τα κύτταρα θηλαστικών παράγουν επί του παρόντος τους πιο θεραπευτικούς παράγοντες επειδή οι συνθέσεις τους είναι ικανές να παράγουν υψηλής ποιότητας ουσίες που μοιάζουν με φυσικές ουσίες. Επιπλέον, πολλές εγκεκριμένες ανασυνδυασμένες θεραπευτικές πρωτεΐνες παράγονται στο E. coli λόγω καλής γενετικής, ταχείας ανάπτυξης και υψηλής παραγωγικότητας. Έχει επίσης θετική επίδραση στην ανάπτυξη φαρμάκων που βασίζονται σε αυτή την ουσία.
Έρευνα
Η λήψη ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών βασίζεται σε διαφορετικές μεθόδους. Οι ουσίες βοηθούν να ανακαλύψουμε τις βασικές και θεμελιώδεις αρχές του σώματος. Αυτά τα μόρια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αναγνώριση και τον προσδιορισμόθέση της ουσίας που κωδικοποιείται από ένα συγκεκριμένο γονίδιο και για να αποκαλύψει τη λειτουργία άλλων γονιδίων σε διάφορες κυτταρικές δραστηριότητες όπως η κυτταρική σηματοδότηση, ο μεταβολισμός, η ανάπτυξη, η αντιγραφή και ο θάνατος, η μεταγραφή, η μετάφραση και η τροποποίηση των ενώσεων που συζητούνται στο άρθρο.
Έτσι, η παρατηρούμενη σύνθεση χρησιμοποιείται συχνά στη μοριακή βιολογία, την κυτταρική βιολογία, τη βιοχημεία, τις δομικές και βιοφυσικές μελέτες και πολλούς άλλους τομείς της επιστήμης. Ταυτόχρονα, η απόκτηση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών αποτελεί διεθνή πρακτική.
Τέτοιες ενώσεις είναι χρήσιμα εργαλεία για την κατανόηση των διακυτταρικών αλληλεπιδράσεων. Έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικά σε διάφορες εργαστηριακές μεθόδους όπως η ELISA και η ανοσοϊστοχημεία (IHC). Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη ενζυμικών δοκιμασιών. Όταν χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με ένα ζεύγος κατάλληλων αντισωμάτων, τα κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πρότυπα για νέες τεχνολογίες.
Βιοτεχνολογία
Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που περιέχουν μια αλληλουχία αμινοξέων χρησιμοποιούνται επίσης στη βιομηχανία, την παραγωγή τροφίμων, τη γεωργία και τη βιομηχανική. Για παράδειγμα, στην κτηνοτροφία, μπορούν να προστεθούν ένζυμα στα τρόφιμα για να αυξήσουν τη θρεπτική αξία των συστατικών των ζωοτροφών, να μειώσουν το κόστος και τα απόβλητα, να υποστηρίξουν την υγεία του εντέρου των ζώων, να βελτιώσουν την παραγωγικότητα και να βελτιώσουν το περιβάλλον.
Επιπλέον, βακτήρια γαλακτικού οξέος (LAB) για μεγάλο χρονικό διάστημαέχουν χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή τροφών που έχουν υποστεί ζύμωση και πρόσφατα αναπτύχθηκε LAB για την έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών που περιέχουν μια αλληλουχία αμινοξέων, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί ευρέως, για παράδειγμα, για τη βελτίωση της πέψης στον άνθρωπο, στα ζώα και στη διατροφή.
Ωστόσο, αυτές οι ουσίες έχουν επίσης περιορισμούς:
- Σε ορισμένες περιπτώσεις, η παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών είναι πολύπλοκη, δαπανηρή και χρονοβόρα.
- Ουσίες που παράγονται στα κύτταρα ενδέχεται να μην ταιριάζουν με τις φυσικές μορφές. Αυτή η διαφορά μπορεί να μειώσει την αποτελεσματικότητα των θεραπευτικών ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και ακόμη και να προκαλέσει παρενέργειες. Επιπλέον, αυτή η διαφορά μπορεί να επηρεάσει τα αποτελέσματα των πειραμάτων.
- Το κύριο πρόβλημα με όλα τα ανασυνδυασμένα φάρμακα είναι η ανοσογονικότητα. Όλα τα προϊόντα βιοτεχνολογίας μπορούν να παρουσιάσουν κάποια μορφή ανοσογονικότητας. Είναι δύσκολο να προβλεφθεί η ασφάλεια νέων θεραπευτικών πρωτεϊνών.
Γενικά, η πρόοδος στη βιοτεχνολογία έχει αυξήσει και διευκολύνει την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών για ποικίλες εφαρμογές. Αν και εξακολουθούν να έχουν ορισμένα μειονεκτήματα, οι ουσίες είναι σημαντικές στην ιατρική, την έρευνα και τη βιοτεχνολογία.
Σύνδεσμος ασθένειας
Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη δεν είναι επιβλαβής για τον άνθρωπο. Είναι μόνο ένα αναπόσπαστο μέρος του συνολικού μορίου στην ανάπτυξη ενός συγκεκριμένου φαρμάκου ή θρεπτικού στοιχείου. Πολλές ιατρικές μελέτες έχουν δείξει ότι η αναγκαστική έκφραση της πρωτεΐνης FGFBP3 (συντομογραφία BP3) σε ένα εργαστηριακό στέλεχος παχύσαρκων ποντικών έδειξε σημαντική μείωση στο σωματικό τους λίπος.μάζα, παρά τη γενετική προδιάθεση για χρήση.
Τα αποτελέσματα αυτών των δοκιμών δείχνουν ότι η πρωτεΐνη FGFBP3 μπορεί να προσφέρει μια νέα θεραπεία για διαταραχές που σχετίζονται με μεταβολικό σύνδρομο όπως ο διαβήτης τύπου 2 και η λιπώδης ηπατική νόσος. Επειδή όμως η BP3 είναι μια φυσική πρωτεΐνη και όχι ένα τεχνητό φάρμακο, οι κλινικές δοκιμές της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης BP3 θα μπορούσαν να ξεκινήσουν μετά τον τελευταίο γύρο προκλινικών μελετών. Επί, δηλαδή, υπάρχουν λόγοι που σχετίζονται με την ασφάλεια της διεξαγωγής τέτοιων μελετών. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη δεν είναι επιβλαβής για τον άνθρωπο λόγω της σταδιακής επεξεργασίας και καθαρισμού της. Αλλαγές γίνονται και σε μοριακό επίπεδο.
Το PD-L2, ένας από τους βασικούς παίκτες στην ανοσοθεραπεία, προτάθηκε για το Νόμπελ Φυσιολογίας ή Ιατρικής 2018. Αυτή η εργασία, που ξεκίνησε από τον καθηγητή James P. Allison από τις ΗΠΑ και τον καθηγητή Tasuku Honjo από την Ιαπωνία, οδήγησε στη θεραπεία καρκίνων όπως το μελάνωμα, ο καρκίνος του πνεύμονα και άλλων με βάση την ανοσοθεραπεία του σημείου ελέγχου. Πρόσφατα, η AMSBIO πρόσθεσε ένα σημαντικό νέο προϊόν στη σειρά ανοσοθεραπειών της, τον ενεργοποιητή PD-L2/TCR - CHO Recombinant Cell Line.
Σε πειράματα απόδειξης της ιδέας, ερευνητές στο Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, με επικεφαλής τον H. Long Zheng, MD, τον καθηγητή Robert B. Adams, και τον Διευθυντή Εργαστηριακής Ιατρικής, Τμήμα Παθολογίας, Σχολή UAB Η ιατρική, έχει επισημάνει μια πιθανή θεραπεία, μια σπάνια αλλά θανατηφόρα αιμορραγική διαταραχή, την TTP.
Τα αποτελέσματα αυτούμελέτες καταδεικνύουν για πρώτη φορά ότι η μετάγγιση αιμοπεταλίων φορτωμένων με rADAMTS13 μπορεί να είναι μια νέα και δυνητικά αποτελεσματική θεραπευτική προσέγγιση για την αρτηριακή θρόμβωση που σχετίζεται με τη συγγενή και την προκαλούμενη από το ανοσοποιητικό TTP.
Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη δεν είναι μόνο θρεπτικό συστατικό, αλλά και φάρμακο στη σύνθεση του φαρμάκου που αναπτύσσεται. Αυτοί είναι μόνο λίγοι τομείς που ασχολούνται πλέον με την ιατρική και σχετίζονται με τη μελέτη όλων των δομικών στοιχείων της. Όπως δείχνει η διεθνής πρακτική, η δομή μιας ουσίας καθιστά δυνατή σε μοριακό επίπεδο την αντιμετώπιση πολλών σοβαρών προβλημάτων στο ανθρώπινο σώμα.
Ανάπτυξη εμβολίου
Μια ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη είναι ένα συγκεκριμένο σύνολο μορίων που μπορεί να διαμορφωθεί. Μια παρόμοια ιδιότητα χρησιμοποιείται στην ανάπτυξη εμβολίων. Μια νέα στρατηγική εμβολιασμού, γνωστή και ως χρήση ειδικής ένεσης ανασυνδυασμένου ιού, θα μπορούσε να προστατεύσει εκατομμύρια κοτόπουλα που κινδυνεύουν από μια σοβαρή αναπνευστική ασθένεια, δήλωσαν ερευνητές από το Πανεπιστήμιο του Εδιμβούργου και το Ινστιτούτο Pirbright. Αυτά τα εμβόλια χρησιμοποιούν αβλαβείς ή αδύναμες εκδοχές ενός ιού ή βακτηρίου για να εισάγουν μικρόβια στα κύτταρα του σώματος. Σε αυτή την περίπτωση, οι ειδικοί χρησιμοποίησαν ανασυνδυασμένους ιούς με διαφορετικές πρωτεΐνες ακίδας ως εμβόλια για να δημιουργήσουν δύο εκδοχές ενός αβλαβούς ιού. Υπάρχουν πολλά διαφορετικά φάρμακα που χτίζονται γύρω από αυτή τη σύνδεση.
Οι εμπορικές ονομασίες και τα ανάλογα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης έχουν ως εξής:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Αυτά είναι κυρίως αντικαρκινικά φάρμακα, αλλά υπάρχουν και άλλοι τομείς θεραπείας που σχετίζονται με αυτήν τη δραστική ουσία.
Ένα νέο εμβόλιο, που ονομάζεται επίσης LASSARAB, που έχει σχεδιαστεί για να προστατεύει τους ανθρώπους τόσο από τον πυρετό Lassa όσο και από τη λύσσα, έχει δείξει πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα σε προκλινικές μελέτες, σύμφωνα με μια νέα μελέτη που δημοσιεύτηκε στο επιστημονικό περιοδικό Nature Communications. Ένα αδρανοποιημένο ανασυνδυασμένο εμβόλιο που είναι υποψήφιο χρησιμοποιεί έναν εξασθενημένο ιό της λύσσας.
Η ερευνητική ομάδα εισήγαγε γενετικό υλικό του ιού Lassa σε φορέα ιού λύσσας, έτσι ώστε το εμβόλιο να εκφράζει επιφανειακές πρωτεΐνες τόσο στα κύτταρα Lassa όσο και στα κύτταρα της λύσσας. Αυτές οι επιφανειακές ενώσεις προκαλούν μια ανοσοαπόκριση έναντι μολυσματικών παραγόντων. Αυτό το εμβόλιο στη συνέχεια απενεργοποιήθηκε για να «καταστραφεί» ο ζωντανός ιός της λύσσας που χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία του φορέα.
Λήψη μεθόδων
Υπάρχουν πολλά συστήματα για την παραγωγή μιας ουσίας. Η γενική μέθοδος για τη λήψη μιας ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης βασίζεται στη λήψη βιολογικού υλικού από τη σύνθεση. Αλλά υπάρχουν και άλλοι τρόποι.
Προς το παρόν υπάρχουν πέντε κύρια συστήματα έκφρασης:
- Σύστημα έκφρασης E. coli.
- Σύστημα έκφρασης μαγιάς.
- Σύστημα έκφρασης κυττάρων εντόμων.
- Σύστημα έκφρασης κυττάρων θηλαστικών.
- Σύστημα έκφρασης πρωτεΐνης χωρίς κύτταρα.
Η τελευταία επιλογή είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για την έκφραση διαμεμβρανικών πρωτεϊνώνκαι τοξικές ενώσεις. Τα τελευταία χρόνια, ουσίες που είναι δύσκολο να εκφραστούν με συμβατικές ενδοκυτταρικές μεθόδους έχουν ενσωματωθεί με επιτυχία στα κύτταρα in vitro. Στη Λευκορωσία, η παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών χρησιμοποιείται ευρέως. Υπάρχει ένας αριθμός κρατικών επιχειρήσεων που ασχολούνται με αυτό το ζήτημα.
Το Σύστημα Σύνθεσης Χωρίς Κύτταρα είναι μια γρήγορη και αποτελεσματική μέθοδος για τη σύνθεση ουσιών-στόχων με την προσθήκη διαφόρων υποστρωμάτων και ενεργειακών ενώσεων απαραίτητων για τη μεταγραφή και μετάφραση στο ενζυματικό σύστημα κυτταρικών εκχυλισμάτων. Τα τελευταία χρόνια, τα πλεονεκτήματα των μεθόδων χωρίς κύτταρα για τύπους ουσιών όπως σύνθετες, τοξικές μεμβράνες έχουν προκύψει σταδιακά, αποδεικνύοντας την πιθανή εφαρμογή τους στον βιοφαρμακευτικό τομέα.
Η τεχνολογία χωρίς κύτταρα μπορεί να προσθέσει μια ποικιλία από μη φυσικά απαντώμενα αμινοξέα εύκολα και με ελεγχόμενο τρόπο για να επιτύχει πολύπλοκες διαδικασίες τροποποίησης που είναι δύσκολο να επιλυθούν μετά από συμβατική ανασυνδυασμένη έκφραση. Τέτοιες μέθοδοι έχουν υψηλή αξία εφαρμογής και δυνατότητα για χορήγηση φαρμάκων και ανάπτυξη εμβολίων χρησιμοποιώντας σωματίδια που μοιάζουν με ιούς. Ένας μεγάλος αριθμός μεμβρανικών πρωτεϊνών έχει εκφραστεί με επιτυχία σε ελεύθερα κύτταρα.
Έκφραση συνθέσεων
Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη CFP10-ESAT 6 παράγεται και χρησιμοποιείται για τη δημιουργία εμβολίων. Ένα τέτοιο αλλεργιογόνο φυματίωσης σας επιτρέπει να ενισχύσετε το ανοσοποιητικό σύστημα και να αναπτύξετε αντισώματα. Γενικά, οι μοριακές μελέτες περιλαμβάνουν τη μελέτη οποιασδήποτε πτυχής μιας πρωτεΐνης, όπως η δομή, η λειτουργία, οι τροποποιήσεις, ο εντοπισμός ή οι αλληλεπιδράσεις. Να εξερευνήσωπώς συγκεκριμένες ουσίες ρυθμίζουν τις εσωτερικές διεργασίες, οι ερευνητές συνήθως απαιτούν τα μέσα για την παραγωγή λειτουργικών ενώσεων ενδιαφέροντος και οφέλους.
Δεδομένου του μεγέθους και της πολυπλοκότητας των πρωτεϊνών, η χημική σύνθεση δεν είναι μια βιώσιμη επιλογή για αυτήν την προσπάθεια. Αντίθετα, τα ζωντανά κύτταρα και ο κυτταρικός τους μηχανισμός χρησιμοποιούνται συνήθως ως εργοστάσια για τη δημιουργία και την κατασκευή ουσιών με βάση τα παρεχόμενα γενετικά πρότυπα. Το σύστημα έκφρασης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης δημιουργεί στη συνέχεια την απαραίτητη δομή για τη δημιουργία ενός φαρμάκου. Ακολουθεί η επιλογή του απαραίτητου υλικού για διάφορες κατηγορίες φαρμάκων.
Σε αντίθεση με τις πρωτεΐνες, το DNA είναι εύκολο να κατασκευαστεί συνθετικά ή in vitro χρησιμοποιώντας καθιερωμένες τεχνικές ανασυνδυασμού. Επομένως, εκμαγεία DNA συγκεκριμένων γονιδίων, με ή χωρίς προστιθέμενες αλληλουχίες αναφοράς ή αλληλουχίες ετικετών συγγένειας, μπορούν να σχεδιαστούν ως υποδείγματα έκφρασης της παρακολουθούμενης ουσίας. Τέτοιες ενώσεις που προέρχονται από τέτοια πρότυπα DNA ονομάζονται ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες.
Παραδοσιακές στρατηγικές για την έκφραση μιας ουσίας περιλαμβάνουν τη διαμόλυνση κυττάρων με έναν φορέα DNA που περιέχει ένα εκμαγείο και στη συνέχεια την καλλιέργεια των κυττάρων για τη μεταγραφή και τη μετάφραση της επιθυμητής πρωτεΐνης. Τυπικά, τα κύτταρα στη συνέχεια λύονται για να εκχυλιστεί η εκφρασμένη ένωση για μετέπειτα καθαρισμό. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη CFP10-ESAT6 επεξεργάζεται με αυτόν τον τρόπο και διέρχεται από ένα σύστημα καθαρισμού από πιθανήο σχηματισμός τοξινών. Μόνο μετά από αυτό πηγαίνει να συντεθεί σε εμβόλιο.
Τόσο τα προκαρυωτικά όσο και τα ευκαρυωτικά in vivo συστήματα έκφρασης για μοριακές ουσίες χρησιμοποιούνται ευρέως. Η επιλογή του συστήματος εξαρτάται από τον τύπο της πρωτεΐνης, την απαίτηση για λειτουργική δραστηριότητα και την επιθυμητή απόδοση. Αυτά τα συστήματα έκφρασης περιλαμβάνουν θηλαστικά, έντομα, ζυμομύκητες, βακτήρια, φύκια και κύτταρα. Κάθε σύστημα έχει τα δικά του πλεονεκτήματα και προκλήσεις και η επιλογή του σωστού συστήματος για μια συγκεκριμένη εφαρμογή είναι σημαντική για την επιτυχή έκφραση της υπό εξέταση ουσίας.
Έκφραση από θηλαστικά
Η χρήση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών επιτρέπει την ανάπτυξη εμβολίων και φαρμάκων διαφόρων επιπέδων. Για αυτό, μπορεί να χρησιμοποιηθεί αυτή η μέθοδος λήψης μιας ουσίας. Τα συστήματα έκφρασης θηλαστικών μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή πρωτεϊνών από το ζωικό βασίλειο που έχουν την πιο φυσική δομή και δραστηριότητα λόγω του φυσιολογικά σχετικού περιβάλλοντος τους. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα υψηλά επίπεδα μετα-μεταφραστικής επεξεργασίας και λειτουργικής δραστηριότητας. Τα συστήματα έκφρασης θηλαστικών μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή αντισωμάτων, συμπλεγματικών πρωτεϊνών και ενώσεων για χρήση σε λειτουργικές δοκιμασίες βασισμένες σε κύτταρα. Ωστόσο, αυτά τα οφέλη συνδυάζονται με πιο αυστηρές συνθήκες καλλιέργειας.
Συστήματα έκφρασης θηλαστικών μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη δημιουργία πρωτεϊνών παροδικά ή μέσω σταθερών κυτταρικών γραμμών όπου το κατασκεύασμα έκφρασης είναι ενσωματωμένο στο γονιδίωμα του ξενιστή. Ενώ τέτοια συστήματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε πολλαπλά πειράματα, ο χρόνοςη παραγωγή μπορεί να δημιουργήσει μεγάλη ποσότητα ουσίας σε μία έως δύο εβδομάδες. Αυτός ο τύπος βιοτεχνολογίας ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών έχει μεγάλη ζήτηση.
Αυτά τα παροδικά, υψηλής απόδοσης συστήματα έκφρασης θηλαστικών χρησιμοποιούν καλλιέργειες εναιωρήματος και μπορούν να αποδώσουν γραμμάρια ανά λίτρο. Επιπλέον, αυτές οι πρωτεΐνες έχουν περισσότερες εγγενείς αναδιπλούμενες και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως η γλυκοζυλίωση σε σύγκριση με άλλα συστήματα έκφρασης.
Έκφραση εντόμων
Οι μέθοδοι για την παραγωγή ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης δεν περιορίζονται στα θηλαστικά. Υπάρχουν επίσης πιο παραγωγικοί τρόποι όσον αφορά το κόστος παραγωγής, αν και η απόδοση της ουσίας ανά 1 λίτρο επεξεργασμένου υγρού είναι πολύ χαμηλότερη.
Τα κύτταρα εντόμων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την έκφραση μιας πρωτεΐνης υψηλού επιπέδου με τροποποιήσεις παρόμοιες με τα συστήματα των θηλαστικών. Υπάρχουν πολλά συστήματα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη δημιουργία ανασυνδυασμένου βακουλοϊού, ο οποίος μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί για την εξαγωγή της ουσίας που μας ενδιαφέρει στα κύτταρα των εντόμων.
Οι εκφράσεις των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών μπορούν εύκολα να κλιμακωθούν και να προσαρμοστούν σε καλλιέργεια αιωρήματος υψηλής πυκνότητας για σύνθεση μορίων μεγάλης κλίμακας. Είναι πιο λειτουργικά παρόμοια με τη φυσική σύνθεση της ύλης των θηλαστικών. Αν και η απόδοση μπορεί να είναι έως και 500 mg/L, η παραγωγή ανασυνδυασμένου βακουλοϊού μπορεί να είναι χρονοβόρα και οι συνθήκες καλλιέργειας είναι πιο δύσκολες από τα προκαρυωτικά συστήματα. Ωστόσο, σε πιο νότιες και θερμότερες χώρες, ένα παρόμοιοη μέθοδος θεωρείται πιο αποτελεσματική.
Βακτηριακή έκφραση
Η παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών μπορεί να εδραιωθεί με τη βοήθεια βακτηρίων. Αυτή η τεχνολογία είναι πολύ διαφορετική από αυτές που περιγράφονται παραπάνω. Τα συστήματα έκφρασης βακτηριακών πρωτεϊνών είναι δημοφιλή επειδή τα βακτήρια καλλιεργούνται εύκολα, αναπτύσσονται γρήγορα και δίνουν υψηλές αποδόσεις της ανασυνδυασμένης σύνθεσης. Ωστόσο, οι ευκαρυωτικές ουσίες πολλαπλών τομέων που εκφράζονται σε βακτήρια είναι συχνά μη λειτουργικές επειδή τα κύτταρα δεν είναι εξοπλισμένα για να πραγματοποιήσουν τις απαραίτητες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις ή τη μοριακή αναδίπλωση.
Επιπλέον, πολλές πρωτεΐνες γίνονται αδιάλυτες ως μόρια εγκλεισμού, τα οποία είναι πολύ δύσκολο να ανακτηθούν χωρίς σκληρούς μετουσιωτές και επακόλουθες δύσκαμπτες διαδικασίες μοριακής αναδίπλωσης. Αυτή η μέθοδος θεωρείται ως επί το πλείστον ακόμα σε μεγάλο βαθμό πειραματική.
Έκφραση χωρίς κύτταρα
Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη που περιέχει την αλληλουχία αμινοξέων της σταφυλοκινάσης λαμβάνεται με ελαφρώς διαφορετικό τρόπο. Περιλαμβάνεται σε πολλούς τύπους ενέσεων, απαιτώντας πολλά συστήματα πριν από τη χρήση.
Η έκφραση πρωτεΐνης χωρίς κύτταρα είναι μια in vitro σύνθεση μιας ουσίας που χρησιμοποιεί μεταφραστικά συμβατά εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων. Κατ 'αρχήν, τα εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων περιέχουν όλα τα μακρομόρια και τα συστατικά που απαιτούνται για τη μεταγραφή, τη μετάφραση, ακόμη και τη μετα-μεταφραστική τροποποίηση.
Αυτά τα συστατικά περιλαμβάνουν RNA πολυμεράση, ρυθμιστικούς πρωτεϊνικούς παράγοντες, μεταγραφικές μορφές, ριβοσώματα και tRNA. Κατά την προσθήκησυμπαράγοντες, νουκλεοτίδια και ένα συγκεκριμένο πρότυπο γονιδίου, αυτά τα εκχυλίσματα μπορούν να συνθέσουν πρωτεΐνες ενδιαφέροντος σε λίγες ώρες.
Αν και δεν είναι βιώσιμα για παραγωγή μεγάλης κλίμακας, τα συστήματα έκφρασης πρωτεΐνης χωρίς κύτταρα ή in vitro (IVT) προσφέρουν ορισμένα πλεονεκτήματα σε σχέση με τα συμβατικά συστήματα in vivo.
Η έκφραση χωρίς κύτταρα επιτρέπει την ταχεία σύνθεση ανασυνδυασμένων σκευασμάτων χωρίς να περιλαμβάνει κυτταρική καλλιέργεια. Τα συστήματα χωρίς κύτταρα καθιστούν δυνατή την επισήμανση πρωτεϊνών με τροποποιημένα αμινοξέα, καθώς και την έκφραση ενώσεων που υφίστανται ταχεία πρωτεολυτική αποικοδόμηση από ενδοκυτταρικές πρωτεάσες. Επιπλέον, είναι ευκολότερο να εκφραστούν πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες ταυτόχρονα χρησιμοποιώντας μια μέθοδο χωρίς κύτταρα (για παράδειγμα, δοκιμή μεταλλάξεων πρωτεΐνης με έκφραση μικρής κλίμακας από πολλά διαφορετικά πρότυπα ανασυνδυασμένου DNA). Σε αυτό το αντιπροσωπευτικό πείραμα, το σύστημα IVT χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση της ανθρώπινης πρωτεΐνης κασπάσης-3.
Συμπεράσματα και μελλοντικές προοπτικές
Η παραγωγή ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης μπορεί πλέον να θεωρηθεί ως μια ώριμη πειθαρχία. Αυτό είναι το αποτέλεσμα πολλών σταδιακών βελτιώσεων στον καθαρισμό και την ανάλυση. Επί του παρόντος, τα προγράμματα ανακάλυψης φαρμάκων σπάνια διακόπτονται λόγω της αδυναμίας παραγωγής της πρωτεΐνης στόχου. Παράλληλες διαδικασίες για την έκφραση, τον καθαρισμό και την ανάλυση αρκετών ανασυνδυασμένων ουσιών είναι πλέον ευρέως γνωστές σε πολλά εργαστήρια σε όλο τον κόσμο.
Σύμπλοκα πρωτεΐνης και αυξανόμενη επιτυχία στην παραγωγήΟι διαλυτοποιημένες μεμβρανικές δομές θα απαιτήσουν περισσότερες αλλαγές για να συμβαδίσουν με τη ζήτηση. Η εμφάνιση αποτελεσματικών ερευνητικών οργανισμών με σύμβαση για πιο τακτική προμήθεια πρωτεϊνών θα επιτρέψει την ανακατανομή των επιστημονικών πόρων για την αντιμετώπιση αυτών των νέων προκλήσεων.
Επιπλέον, οι παράλληλες ροές εργασίας θα πρέπει να επιτρέπουν τη δημιουργία πλήρων βιβλιοθηκών της παρακολουθούμενης ουσίας που θα επιτρέψουν την ταυτοποίηση νέων στόχων και τον προηγμένο έλεγχο, μαζί με τα παραδοσιακά έργα ανακάλυψης φαρμάκων μικρών μορίων.
