Η απορρόφηση και περαιτέρω επανεκπομπή φωτός από ανόργανα και οργανικά μέσα είναι αποτέλεσμα φωσφορισμού ή φθορισμού. Η διαφορά μεταξύ των φαινομένων είναι το μήκος του διαστήματος μεταξύ της απορρόφησης φωτός και της εκπομπής του ρεύματος. Με τον φθορισμό, αυτές οι διεργασίες συμβαίνουν σχεδόν ταυτόχρονα και με τον φωσφορισμό, με κάποια καθυστέρηση.
Ιστορικό υπόβαθρο
Το 1852, ο Βρετανός επιστήμονας Stokes περιέγραψε για πρώτη φορά τον φθορισμό. Επινόησε τον νέο όρο ως αποτέλεσμα των πειραμάτων του με αργυραδάμαντα, ο οποίος εξέπεμπε κόκκινο φως όταν εκτεθεί στο υπεριώδες φως. Ο Στόουκς σημείωσε ένα ενδιαφέρον φαινόμενο. Βρήκε ότι το μήκος κύματος του φωτός φθορισμού είναι πάντα μεγαλύτερο από αυτό του φωτός διέγερσης.
Πολλά πειράματα πραγματοποιήθηκαν τον 19ο αιώνα για να επιβεβαιώσουν την υπόθεση. Έδειξαν ότι μια ποικιλία δειγμάτων φθορίζει όταν εκτίθεται στο υπεριώδες φως. Στα υλικά περιλαμβάνονται, μεταξύ άλλων, κρύσταλλοι, ρητίνες, μέταλλα, χλωροφύλλη,φαρμακευτικές πρώτες ύλες, ανόργανες ενώσεις, βιταμίνες, έλαια. Η άμεση χρήση βαφών για βιολογική ανάλυση ξεκίνησε μόλις το 1930
Περιγραφή μικροσκοπίου φθορισμού
Μερικά από τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στην έρευνα κατά το πρώτο μισό του 20ού αιώνα ήταν πολύ συγκεκριμένα. Χάρη σε δείκτες που δεν μπορούσαν να επιτευχθούν με μεθόδους αντίθεσης, η μέθοδος μικροσκοπίας φθορισμού έχει γίνει σημαντικό εργαλείο τόσο στη βιοϊατρική όσο και στη βιολογική έρευνα. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν δεν είχαν μικρή σημασία για την επιστήμη των υλικών.
Ποια είναι τα οφέλη της μικροσκοπίας φθορισμού; Με τη βοήθεια νέων υλικών, κατέστη δυνατή η απομόνωση πολύ ειδικών κυττάρων και υπομικροσκοπικών συστατικών. Ένα μικροσκόπιο φθορισμού σάς επιτρέπει να ανιχνεύσετε μεμονωμένα μόρια. Μια ποικιλία βαφών σάς επιτρέπει να αναγνωρίζετε πολλά στοιχεία ταυτόχρονα. Αν και η χωρική ανάλυση του εξοπλισμού περιορίζεται από το όριο περίθλασης, το οποίο, με τη σειρά του, εξαρτάται από τις συγκεκριμένες ιδιότητες του δείγματος, η ανίχνευση μορίων κάτω από αυτό το επίπεδο είναι επίσης αρκετά πιθανή. Διάφορα δείγματα εμφανίζουν αυτοφθορισμό μετά την ακτινοβόληση. Αυτό το φαινόμενο χρησιμοποιείται ευρέως στη βιομηχανία πετρολογίας, βοτανικής, ημιαγωγών.
Λειτουργίες
Η μελέτη ζωικών ιστών ή παθογόνων μικροοργανισμών συχνά περιπλέκεται είτε από πολύ ασθενή είτε από πολύ ισχυρό μη ειδικό αυτοφθορισμό. Ωστόσο, η αξία σεΗ έρευνα αποκτά την εισαγωγή στο υλικό συστατικών που διεγείρονται σε συγκεκριμένο μήκος κύματος και εκπέμπουν φωτεινή ροή της απαιτούμενης έντασης. Τα φθοριόχρωμα δρουν ως βαφές ικανές να αυτοπροσκολληθούν σε δομές (αόρατες ή ορατές). Ταυτόχρονα, διακρίνονται από υψηλή επιλεκτικότητα ως προς τους στόχους και την κβαντική απόδοση.
Η μικροσκοπία φθορισμού έχει γίνει ευρέως χρησιμοποιούμενη με την εμφάνιση φυσικών και συνθετικών βαφών. Είχαν συγκεκριμένα προφίλ έντασης εκπομπής και διέγερσης και στόχευαν σε συγκεκριμένους βιολογικούς στόχους.
Ταυτοποίηση μεμονωμένων μορίων
Συχνά, υπό ιδανικές συνθήκες, μπορείτε να καταγράψετε τη λάμψη ενός μόνο στοιχείου. Για να γίνει αυτό, μεταξύ άλλων, είναι απαραίτητο να εξασφαλιστεί επαρκώς χαμηλός θόρυβος ανιχνευτή και οπτικό φόντο. Ένα μόριο φλουορεσκεΐνης μπορεί να εκπέμψει έως και 300.000 φωτόνια πριν από την καταστροφή λόγω της φωτολεύκανσης. Με ποσοστό συλλογής 20% και αποτελεσματικότητα διαδικασίας, μπορούν να εγγραφούν στο ποσό των περίπου 60 χιλιάδων
Μικροσκοπία φθορισμού, βασισμένη σε φωτοδίοδοι χιονοστιβάδας ή πολλαπλασιασμό ηλεκτρονίων, επέτρεψε στους ερευνητές να παρατηρήσουν τη συμπεριφορά μεμονωμένων μορίων για δευτερόλεπτα, και σε ορισμένες περιπτώσεις για λεπτά.
Δυσκολίες
Το βασικό πρόβλημα είναι η καταστολή θορύβου από το οπτικό φόντο. Λόγω του γεγονότος ότι πολλά από τα υλικά που χρησιμοποιούνται στην κατασκευή φίλτρων και φακών παρουσιάζουν κάποιο αυτοφθορισμό, οι προσπάθειες των επιστημόνων στα αρχικά στάδια επικεντρώθηκαν στην έκδοσηεξαρτήματα με χαμηλό φθορισμό. Ωστόσο, τα πειράματα που ακολούθησαν οδήγησαν σε νέα συμπεράσματα. Συγκεκριμένα, η μικροσκοπία φθορισμού που βασίζεται στην ολική εσωτερική ανάκλαση έχει βρεθεί ότι επιτυγχάνει χαμηλή απόδοση φωτός φόντου και υψηλής διέγερσης.
Μηχανισμός
Οι αρχές της μικροσκοπίας φθορισμού που βασίζονται στην ολική εσωτερική ανάκλαση είναι η χρήση ενός ταχέως αποσυντιθέμενου ή μη διαδιδόμενου κύματος. Εμφανίζεται στη διεπαφή μεταξύ μέσων με διαφορετικούς δείκτες διάθλασης. Σε αυτή την περίπτωση, η δέσμη φωτός διέρχεται από ένα πρίσμα. Έχει υψηλό δείκτη διάθλασης.
Το πρίσμα βρίσκεται δίπλα σε υδατικό διάλυμα ή γυαλί χαμηλής παραμέτρου. Εάν η δέσμη φωτός κατευθύνεται προς αυτό σε γωνία μεγαλύτερη από την κρίσιμη, η δέσμη ανακλάται πλήρως από τη διεπαφή. Αυτό το φαινόμενο, με τη σειρά του, προκαλεί ένα μη διαδοόμενο κύμα. Με άλλα λόγια, δημιουργείται ένα ηλεκτρομαγνητικό πεδίο που διαπερνά ένα μέσο με χαμηλότερο δείκτη διάθλασης σε απόσταση μικρότερη από 200 νανόμετρα.
Σε ένα κύμα που δεν διαδίδεται, η ένταση του φωτός θα είναι αρκετά επαρκής για να διεγείρει τα φθοροφόρα. Ωστόσο, λόγω του εξαιρετικά μικρού βάθους του, ο όγκος του θα είναι πολύ μικρός. Το αποτέλεσμα είναι ένα φόντο χαμηλού επιπέδου.
Τροποποίηση
Μικροσκοπία φθορισμού που βασίζεται σε συνολική εσωτερική ανάκλαση μπορεί να πραγματοποιηθεί με επι-φωτισμό. Αυτό απαιτεί φακούς με αυξημένο αριθμητικό διάφραγμα (τουλάχιστον 1,4, αλλά είναι επιθυμητό να φτάσει το 1,45-1,6), καθώς και ένα μερικώς φωτισμένο πεδίο της συσκευής. Το τελευταίο επιτυγχάνεται με ένα μικρό σποτ. Για μεγαλύτερη ομοιομορφία, χρησιμοποιείται ένας λεπτός δακτύλιος, μέσω του οποίου μπλοκάρεται μέρος της ροής. Για να ληφθεί μια κρίσιμη γωνία μετά την οποία λαμβάνει χώρα η ολική ανάκλαση, απαιτείται υψηλό επίπεδο διάθλασης του μέσου εμβάπτισης στους φακούς και το γυαλί καλύμματος του μικροσκοπίου.
