Υπάρχουν πολλές διαφορετικές μέθοδοι για την ανάλυση της σύνθεσης και τη μελέτη των ιδιοτήτων διαφόρων ενώσεων και μιγμάτων ουσιών. Μια τέτοια μέθοδος είναι η χρωματογραφία. Η πατρότητα στην εφεύρεση και εφαρμογή της μεθόδου ανήκει στον Ρώσο βοτανολόγο M. S. Tsvet, ο οποίος στις αρχές του 20ου αιώνα πραγματοποίησε τον διαχωρισμό φυτικών χρωστικών.
Ορισμός και βασικές αρχές της μεθόδου
Η χρωματογραφία είναι μια φυσικοχημική μέθοδος για τον διαχωρισμό των μιγμάτων και τον προσδιορισμό των συστατικών τους, με βάση την κατανομή μεταξύ της κινητής και της στατικής φάσης των ουσιών που συνθέτουν το μείγμα (δείγμα). Η στατική φάση είναι μια πορώδης στερεή ουσία - ένα ροφητικό. Μπορεί επίσης να είναι μια υγρή μεμβράνη που εναποτίθεται σε μια στερεή επιφάνεια. Η κινητή φάση - το υγρό έκλουσης - πρέπει να κινείται κατά μήκος της στατικής φάσης ή να ρέει μέσα από αυτήν, φιλτραρισμένη από το ροφητικό.
Η ουσία της χρωματογραφίας είναι ότι διαφορετικά συστατικά ενός μείγματος χαρακτηρίζονται απαραίτητα από διαφορετικές ιδιότητες, όπως μοριακό βάρος, διαλυτότητα, προσροφησιμότητα κ.λπ. Ως εκ τούτου, ο ρυθμός αλληλεπίδρασης των συστατικών της κινητής φάσης - σορβικά - με τη στατικήδεν είναι το ίδιο. Αυτό οδηγεί σε διαφορά στις ταχύτητες των μορίων του μείγματος σε σχέση με τη στατική φάση, με αποτέλεσμα τα συστατικά να διαχωρίζονται και να συγκεντρώνονται σε διαφορετικές ζώνες του ροφητή. Μερικά από αυτά αφήνουν το ροφητικό μαζί με την κινητή φάση - αυτά είναι τα λεγόμενα μη συγκρατημένα συστατικά.
Ένα ιδιαίτερο πλεονέκτημα της χρωματογραφίας είναι ότι σας επιτρέπει να διαχωρίζετε γρήγορα πολύπλοκα μείγματα ουσιών, συμπεριλαμβανομένων εκείνων με παρόμοιες ιδιότητες.
Μέθοδοι ταξινόμησης τύπων χρωματογραφίας
Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση μπορούν να ταξινομηθούν σύμφωνα με διάφορα κριτήρια. Το κύριο σύνολο τέτοιων κριτηρίων είναι το εξής:
- συνολική κατάσταση στατικών και κινητών φάσεων;
- φυσική και χημική φύση της αλληλεπίδρασης του ροφητικού και των σορβικών αλάτων,
- πώς να εισαγάγετε το μέσο έκλουσης και να το μετακινήσετε;
- μέθοδος τοποθέτησης της στατικής φάσης, δηλαδή τεχνική χρωματογραφίας;
- στόχοι χρωματογραφίας.
Επιπλέον, οι μέθοδοι μπορούν να βασίζονται στη διαφορετική φύση της διαδικασίας ρόφησης, στις τεχνικές συνθήκες του χρωματογραφικού διαχωρισμού (για παράδειγμα, χαμηλή ή υψηλή πίεση).
Ας ρίξουμε μια πιο προσεκτική ματιά στα παραπάνω βασικά κριτήρια και τους πιο ευρέως χρησιμοποιούμενους τύπους χρωματογραφίας που σχετίζονται με αυτά.
Κατάσταση συσσωμάτωσης μέσου έκλουσης και ροφητή
Σε αυτή τη βάση, η χρωματογραφία χωρίζεται σε υγρή και αέρια. Τα ονόματα των μεθόδων αντικατοπτρίζουν την κατάσταση της κινητής φάσης.
Η υγρή χρωματογραφία είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείταιστις διεργασίες διαχωρισμού μιγμάτων μακρομοριακών ενώσεων, συμπεριλαμβανομένων των βιολογικά σημαντικών. Ανάλογα με την κατάσταση συσσωμάτωσης του ροφητικού, χωρίζεται σε υγρή-υγρή και υγρή-στερεή φάση.
Η αέρια χρωματογραφία είναι των εξής τύπων:
- Απορρόφηση αερίου (αέριο-στερεό-φάση), που χρησιμοποιεί ένα στερεό ροφητικό, όπως άνθρακα, πυριτική γέλη, ζεόλιθους ή πορώδη πολυμερή. Ένα αδρανές αέριο (αργό, ήλιο), άζωτο, διοξείδιο του άνθρακα δρα ως μέσο έκλουσης - φορέας του μείγματος που πρόκειται να διαχωριστεί. Ο διαχωρισμός των πτητικών συστατικών του μείγματος πραγματοποιείται λόγω του διαφορετικού βαθμού προσρόφησής τους.
- Αέριο-υγρό. Η στατική φάση σε αυτή την περίπτωση αποτελείται από ένα υγρό φιλμ που εναποτίθεται σε μια στερεά αδρανή βάση. Τα συστατικά του δείγματος διαχωρίζονται ανάλογα με την προσροφησιμότητα ή τη διαλυτότητά τους.
Η αέρια χρωματογραφία χρησιμοποιείται ευρέως για την ανάλυση μειγμάτων οργανικών ενώσεων (χρησιμοποιώντας τα προϊόντα αποσύνθεσης ή τα παράγωγά τους σε αέρια μορφή).
Αλληλεπίδραση μεταξύ ροφητικού και σορβικών αλάτων
Σύμφωνα με αυτό το κριτήριο, αυτοί οι τύποι διακρίνονται ως:
- Χρωματογραφία προσρόφησης, μέσω της οποίας διαχωρίζονται τα μείγματα λόγω διαφορών στον βαθμό προσρόφησης ουσιών από ένα ακίνητο ροφητικό.
- Διανομή. Με τη βοήθειά του, ο διαχωρισμός πραγματοποιείται με βάση τη διαφορετική διαλυτότητα των συστατικών του μείγματος. Η διάλυση συμβαίνει είτε στην κινητή και στατική φάση (στην υγρή χρωματογραφία), είτε μόνο στη στατική φάση (σε αέριο-υγρόχρωματογραφία).
- Ιζηματογενές. Αυτή η μέθοδος χρωματογραφίας βασίζεται στη διαφορετική διαλυτότητα των σχηματιζόμενων ιζημάτων των προς διαχωρισμό ουσιών.
- Χρωματογραφία αποκλεισμού ή γέλης. Βασίζεται στη διαφορά στο μέγεθος των μορίων, λόγω της οποίας ποικίλλει η ικανότητά τους να διεισδύουν στους πόρους του ροφητή, το λεγόμενο gel matrix.
- Affine. Αυτή η συγκεκριμένη μέθοδος, η οποία βασίζεται σε έναν ειδικό τύπο βιοχημικής αλληλεπίδρασης διαχωρισμένων ακαθαρσιών με ένα πρόσδεμα που σχηματίζει μια σύνθετη ένωση με έναν αδρανή φορέα στη στατική φάση. Αυτή η μέθοδος είναι αποτελεσματική στον διαχωρισμό μειγμάτων πρωτεϊνών-ενζύμων και είναι κοινή στη βιοχημεία.
- Εναλλαγή ιόντων. Ως παράγοντας διαχωρισμού δείγματος, αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί τη διαφορά στην ικανότητα των συστατικών του μείγματος να ανταλλάσσουν ιόντα με τη στατική φάση (ιοντοανταλλάκτη). Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, τα ιόντα της στατικής φάσης αντικαθίστανται από ιόντα ουσιών στη σύνθεση του εκλούσματος, ενώ λόγω της διαφορετικής συγγένειας του τελευταίου με τον ιονανταλλάκτη προκύπτει διαφορά στην ταχύτητα κίνησης τους και έτσι η το μείγμα διαχωρίζεται. Για τη στατική φάση, οι ρητίνες ανταλλαγής ιόντων χρησιμοποιούνται συχνότερα - ειδικά συνθετικά πολυμερή.
Η ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία έχει δύο επιλογές - ανιονική (διατηρεί αρνητικά ιόντα) και κατιονική (διατηρεί θετικά ιόντα, αντίστοιχα). Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται εξαιρετικά ευρέως: στον διαχωρισμό ηλεκτρολυτών, στοιχείων σπανίων γαιών και υπερουρανίου, στον καθαρισμό του νερού, στην ανάλυση φαρμάκων.
Η διαφορά στις μεθόδους τεχνικής
Υπάρχουν δύο κύριοι τρόποι με τους οποίους το δείγμα κινείται σε σχέση με τη στατική φάση:
- Η χρωματογραφία στήλης πραγματοποιεί τη διαδικασία διαχωρισμού σε μια ειδική συσκευή - μια χρωματογραφική στήλη - ένα σωλήνα, στην εσωτερική κοιλότητα του οποίου τοποθετείται ένα ακίνητο ροφητικό. Σύμφωνα με τη μέθοδο πλήρωσης, οι στήλες χωρίζονται σε δύο τύπους: συσκευασμένες (οι λεγόμενες «συσκευασμένες») και τριχοειδείς, στις οποίες εφαρμόζεται ένα στρώμα στερεού ροφητικού ή υγρού φιλμ της στατικής φάσης στην επιφάνεια του τον εσωτερικό τοίχο. Οι συσκευασμένες στήλες μπορούν να έχουν διαφορετικά σχήματα: ίσια, σχήματος U, σπειροειδή. Οι τριχοειδείς στήλες είναι ελικοειδείς.
- Επίπεδη (επίπεδη) χρωματογραφία. Σε αυτή την περίπτωση, ειδικό χαρτί ή πλάκα (μέταλλο, γυαλί ή πλαστικό) μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως φορέας για τη στατική φάση, πάνω στο οποίο εναποτίθεται ένα λεπτό στρώμα ροφητικού. Σε αυτήν την περίπτωση, η μέθοδος χρωματογραφίας αναφέρεται ως χρωματογραφία χαρτιού ή λεπτής στιβάδας, αντίστοιχα.
Σε αντίθεση με τη μέθοδο στήλης, όπου οι χρωματογραφικές στήλες χρησιμοποιούνται επανειλημμένα, στην επίπεδη χρωματογραφία, οποιοσδήποτε φορέας με ροφητικό στρώμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο μία φορά. Η διαδικασία διαχωρισμού συμβαίνει όταν ένα πιάτο ή ένα φύλλο χαρτιού βυθίζεται σε ένα δοχείο με υγρό έκλουσης.
Εισαγωγή και μεταφορά του εκλούτη
Αυτός ο παράγοντας καθορίζει τη φύση της κίνησης των χρωματογραφικών ζωνών κατά μήκος του απορροφητικού στρώματος, οι οποίες σχηματίζονται κατά τον διαχωρισμό του μείγματος. Υπάρχουν οι ακόλουθες μέθοδοι χορήγησης εκλούσματος:
- Μπροστινό μέρος. Αυτή η μέθοδος είναι η απλούστερητεχνική εκτέλεσης. Η κινητή φάση είναι απευθείας το ίδιο το δείγμα, το οποίο τροφοδοτείται συνεχώς στη στήλη γεμάτη με το ροφητικό. Σε αυτή την περίπτωση, το λιγότερο συγκρατημένο συστατικό, που έχει προσροφηθεί χειρότερα από άλλα, κινείται κατά μήκος του ροφητικού γρηγορότερα από τα άλλα. Ως αποτέλεσμα, μόνο αυτό το πρώτο συστατικό μπορεί να απομονωθεί σε καθαρή μορφή, ακολουθούμενο από ζώνες που περιέχουν μείγματα συστατικών. Η κατανομή του δείγματος μοιάζει με αυτό: A; Α+Β; A+B+C και ούτω καθεξής. Η μετωπιαία χρωματογραφία επομένως δεν είναι χρήσιμη για τον διαχωρισμό μειγμάτων, αλλά είναι αποτελεσματική σε διάφορες διαδικασίες καθαρισμού, υπό την προϋπόθεση ότι η ουσία που πρόκειται να απομονωθεί έχει χαμηλή κατακράτηση.
- Η μέθοδος μετατόπισης διαφέρει στο ότι μετά την είσοδο στο μείγμα που πρόκειται να διαχωριστεί, τροφοδοτείται στη στήλη ένα υγρό έκλουσης με ειδικό εκτοπιστή - μια ουσία που χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερη απορροφητικότητα από οποιοδήποτε από τα συστατικά του μείγματος. Μετατοπίζει το πιο συγκρατημένο στοιχείο, το οποίο μετατοπίζει το επόμενο και ούτω καθεξής. Το δείγμα κινείται κατά μήκος της στήλης με την ταχύτητα του εκτοπιστή και σχηματίζει παρακείμενες ζώνες συγκέντρωσης. Με αυτόν τον τύπο χρωματογραφίας, κάθε συστατικό μπορεί να ληφθεί ξεχωριστά σε υγρή μορφή στην έξοδο της στήλης.
- Η μέθοδος έκλουσης (αναπτυξιακή) είναι η πιο κοινή. Σε αντίθεση με τη μέθοδο εκτόπισης, το έκλουσμα (φορέας) σε αυτή την περίπτωση έχει χαμηλότερη απορροφητικότητα από τα συστατικά του δείγματος. Περνάται συνεχώς μέσα από το ροφητικό στρώμα, πλένοντάς το. Περιοδικά, σε δόσεις (παλμούς), το μείγμα που πρόκειται να διαχωριστεί εισάγεται στη ροή του εκλούτη, μετά από το οποίο το καθαρό εκλουστικό τροφοδοτείται ξανά. Κατά την έκπλυση (έκλουση), τα συστατικά διαχωρίζονται,Επιπλέον, οι ζώνες συγκέντρωσής τους διαχωρίζονται από ζώνες εκλούσεως.
Η χρωματογραφία έκλουσης καθιστά δυνατό τον σχεδόν πλήρη διαχωρισμό του αναλυόμενου μείγματος ουσιών και το μείγμα μπορεί να είναι πολλαπλών συστατικών. Επίσης, τα πλεονεκτήματα αυτής της μεθόδου είναι η απομόνωση των συστατικών μεταξύ τους και η απλότητα της ποσοτικής ανάλυσης του μείγματος. Τα μειονεκτήματα περιλαμβάνουν υψηλή κατανάλωση υγρού έκλουσης και χαμηλή συγκέντρωση συστατικών του δείγματος σε αυτό μετά τον διαχωρισμό στην έξοδο της στήλης. Η μέθοδος έκλουσης χρησιμοποιείται ευρέως τόσο στην αέρια όσο και στην υγρή χρωματογραφία.
Χρωματογραφικές διεργασίες ανάλογα με τους σκοπούς
Η διαφορά στους στόχους της χρωματογραφίας καθιστά δυνατή τη διάκριση μεθόδων όπως η αναλυτική, η προπαρασκευαστική και η βιομηχανική.
Με αναλυτική χρωματογραφία πραγματοποιείται ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των μειγμάτων. Κατά την ανάλυση των συστατικών του δείγματος, όταν φεύγουν από τη στήλη του χρωματογράφου, πηγαίνουν στον ανιχνευτή - μια συσκευή που είναι ευαίσθητη στις αλλαγές στη συγκέντρωση μιας ουσίας στο υγρό έκλουσης. Ο χρόνος που μεσολάβησε από τη στιγμή που το δείγμα εισάγεται στη στήλη μέχρι τη μέγιστη μέγιστη συγκέντρωση της ουσίας στον ανιχνευτή ονομάζεται χρόνος κατακράτησης. Με την προϋπόθεση ότι η θερμοκρασία της στήλης και ο ρυθμός έκλουσης είναι σταθερές, αυτή η τιμή είναι σταθερή για κάθε ουσία και χρησιμεύει ως βάση για μια ποιοτική ανάλυση του μείγματος. Η ποσοτική ανάλυση πραγματοποιείται με μέτρηση του εμβαδού των μεμονωμένων κορυφών στο χρωματογράφημα. Κατά κανόνα, η μέθοδος έκλουσης χρησιμοποιείται στην αναλυτική χρωματογραφία.
Η παρασκευαστική χρωματογραφία στοχεύει στην απομόνωση καθαρών ουσιών από ένα μείγμα. Οι προπαρασκευαστικές στήλες έχουν πολύ μεγαλύτεροδιάμετρος από αναλυτική.
Η βιομηχανική χρωματογραφία χρησιμοποιείται, πρώτον, για τη λήψη μεγάλων ποσοτήτων καθαρών ουσιών που απαιτούνται σε μια συγκεκριμένη παραγωγή. Δεύτερον, αποτελεί σημαντικό μέρος των σύγχρονων συστημάτων ελέγχου και ρύθμισης για τεχνολογικές διαδικασίες.
Ο βιομηχανικός χρωματογράφος έχει κλίμακα συγκέντρωσης του ενός ή του άλλου συστατικού και είναι εξοπλισμένος με αισθητήρα, καθώς και συστήματα ελέγχου και καταγραφής. Τα δείγματα παραδίδονται σε τέτοιους χρωματογράφους αυτόματα με συγκεκριμένη συχνότητα.
Πολυλειτουργικός εξοπλισμός χρωματογραφίας
Οι σύγχρονοι χρωματογράφοι είναι σύνθετες συσκευές υψηλής τεχνολογίας που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε διάφορους τομείς και για διάφορους σκοπούς. Αυτές οι συσκευές καθιστούν δυνατή την ανάλυση πολύπλοκων μιγμάτων πολλαπλών συστατικών. Είναι εξοπλισμένα με ένα ευρύ φάσμα ανιχνευτών: θερμική αγωγιμότητα, οπτικό, ιονισμό, φασματομετρικό μάζας και ούτω καθεξής.
Επιπλέον, η σύγχρονη χρωματογραφία χρησιμοποιεί αυτόματα συστήματα ελέγχου για την ανάλυση και την επεξεργασία των χρωματογραφημάτων. Ο έλεγχος μπορεί να εκτελεστεί από υπολογιστή ή απευθείας από τη συσκευή.
Παράδειγμα τέτοιας συσκευής είναι ο πολυλειτουργικός αέριος χρωματογράφος "Crystal 5000". Διαθέτει ένα σετ τεσσάρων ανιχνευτών που μπορούν να αντικατασταθούν, έναν θερμοστάτη στήλης, ηλεκτρονικά συστήματα ελέγχου πίεσης και ροής και χειριστήρια βαλβίδων αερίου. Για την επίλυση διαφόρων προβλημάτων, η συσκευή έχειτη δυνατότητα εγκατάστασης τόσο συσκευασμένων όσο και τριχοειδών στηλών.
Ο χρωματογράφος ελέγχεται χρησιμοποιώντας ένα πληκτρολόγιο και οθόνη ελέγχου με πλήρη χαρακτηριστικά ή (σε άλλη τροποποίηση) από έναν προσωπικό υπολογιστή. Αυτή η συσκευή νέας γενιάς μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά στην παραγωγή και σε διάφορα ερευνητικά εργαστήρια: ιατρικά, εγκληματολογικά, περιβαλλοντικά.
Χρωματογραφία υψηλής πίεσης
Η διεξαγωγή υγρής χρωματογραφίας στήλης χαρακτηρίζεται από μάλλον μεγάλη διάρκεια της διαδικασίας. Για να επιταχυνθεί η κίνηση του υγρού εκλουστικού, χρησιμοποιείται η παροχή της κινητής φάσης στη στήλη υπό πίεση. Αυτή η σύγχρονη και πολλά υποσχόμενη μέθοδος ονομάζεται μέθοδος υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC).
Το σύστημα άντλησης του υγρού χρωματογράφου HPLC παρέχει υγρό έκλουσης με σταθερό ρυθμό. Η ανεπτυγμένη πίεση εισόδου μπορεί να φτάσει τα 40 MPa. Ο έλεγχος μέσω υπολογιστή καθιστά δυνατή την αλλαγή της σύνθεσης της κινητής φάσης σύμφωνα με ένα δεδομένο πρόγραμμα (αυτή η μέθοδος έκλουσης ονομάζεται κλίση).
Το
HPLC μπορεί να χρησιμοποιηθεί με διάφορες μεθόδους που βασίζονται στη φύση της αλληλεπίδρασης του προσροφητικού και του σορβικού: κατανομή, προσρόφηση, αποκλεισμός μεγέθους, χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων. Ο πιο συνηθισμένος τύπος HPLC είναι η μέθοδος ανάστροφης φάσης, που βασίζεται στην υδρόφοβη αλληλεπίδραση μιας πολικής (υδατικής) κινητής φάσης και ενός μη πολικού ροφητή, όπως το silica gel.
Η μέθοδος χρησιμοποιείται ευρέως για διαχωρισμό, ανάλυση,ποιοτικός έλεγχος μη πτητικών, θερμικά ασταθών ουσιών που δεν μπορούν να μετατραπούν σε αέρια κατάσταση. Αυτά είναι αγροχημικά, φάρμακα, συστατικά τροφίμων και άλλες πολύπλοκες ουσίες.
Η σημασία των μελετών χρωματογραφίας
Διαφορετικοί τύποι χρωματογραφίας χρησιμοποιούνται ευρέως σε διάφορους τομείς:
- ανόργανη χημεία;
- πετροχημικά και εξόρυξη;
- βιοχημεία;
- φάρμακα και φαρμακευτικά προϊόντα;
- βιομηχανία τροφίμων;
- οικολογία;
- εγκληματολογία.
Αυτή η λίστα είναι ελλιπής, αλλά αντικατοπτρίζει την κάλυψη των βιομηχανιών που δεν μπορούν να κάνουν χωρίς χρωματογραφικές μεθόδους ανάλυσης, διαχωρισμού και καθαρισμού ουσιών. Σε όλους τους τομείς εφαρμογής της χρωματογραφίας, από τα επιστημονικά εργαστήρια έως τη βιομηχανική παραγωγή, ο ρόλος αυτών των μεθόδων αυξάνεται ακόμη περισσότερο καθώς εισάγονται σύγχρονες τεχνολογίες επεξεργασίας πληροφοριών, διαχείρισης και ελέγχου πολύπλοκων διαδικασιών.
